宋喜臣 吕萍萍 肖雪 汪海波 关朝亮 赵佳 冷德欢

建立了液相色谱-串联质谱法（LC-MS）快速测定蜂蜜中甲硝唑、地美硝唑和洛硝哒唑的检测方法。以水为提取溶剂，加入适量甲醇，乙酸乙酯萃取，经浓缩、复溶、过滤，通过LC-MS法检测枣花蜂蜜中3种硝基咪唑类药物残留，以外标法定量。测定当加入甲硝唑量分别为2.5 μg/kg、10.0 μg/kg和50.0 μg/kg时，回收率分别为85.2%、82.7%和81.0%，当加入地美硝唑量分别为5.0 μg/kg、20.0 μg/kg和100.0 μg/kg时，回收率分别为92.3%、88.4%和88.7%，当加入洛硝哒唑量分别为5.0 μg/kg、20.0 μg/kg和100.0 μg/kg时，回收率分别为92.3%、73.9%和76.6%。甲硝唑、地美硝唑、洛硝哒唑检出限分别为0.1 μg/kg、0.2 μg/kg和0.2 μg/kg。结果表明：该方法稳定性好，准确度高，操作简单、快速，可以满足低残留量的检测要求。

关键词 LC-MS法；蜂蜜；甲硝唑；地美硝唑；洛硝哒唑

Rapid Determination of Metronidazole, Dimetronidazole and Lonidazole in Honey by LC-MS

SONG Xi-Cheng1LV Ping-Ping1XIAO Xue1WANG Hai-Bo1

GUANG Chao-Liang1ZHAO Jia1  LENG De-Huang1

AbstractA rapid method for the determination of metronidazole, dimetronidazole and lornidazole in honey by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS) was established. Three nitroimidazole residues in jujube honey were determined by LC-MS with water as extraction solvent, methanol and ethyl acetate as extraction solvent, followed by concentration, resolving and filtration, the residues were quantified by external standard method.The recoveries were 85.2%,82.7% and 81.0% when adding metronidazole were 2.5μg/kg, 10.0μg/kg and 50.0μg/kgrespectively. When adding metronidazolewere 5.0μg/kg, 20.0μg/kg and 100.0μg/kgrespectively, the recoveries were 92.3%, 88.4% and 88.7%. When adding metronidazole (RNZ) was 5.0μg/kg, 20.0μg/kg and 100.0μg/kgrespectively,the recoveries were 92.3%,73.9% and 76.6%. The detection limits of metronidazole, dimetronidazole and lornidazole were 0.1μg/kg, 0.2μg/kg and 0.2μg/kgrespectively,the results showed that the method was stable, accurate, simple and fast, and could meet the detection requirements of low residues.

Keywords LC-MS method; honey; metronidazole; dimetronidazole; lornidazole

甲硝唑（MNZ）、地美硝唑（DNZ）、洛硝哒唑(RNZ)均为硝基咪唑类药物，有抗菌、抗原虫等作用，但同时也具有致突变性和潜在的致癌性,因此在许多国家被列为违禁药物[1]。我国农业部第235号公告明确指出，食品中禁止添加硝基咪唑类药物。蜂蜜是广受我国人民喜爱的一种食物，但是为了治疗某些疾病，仍有一些蜂农在养蜂的过程中使用硝基咪唑类药物，由于药物可能没被完全排出，导致蜂蜜中残留MNZ、DMZ、RNZ，若食用未经检测的蜂蜜，很有可能影响食用者的身体健康[1]。所以做好蜂蜜质量检测，尤其是针对MNZ、DMZ、RNZ做好检测工作十分必要。

很多文献表示，采用液相色谱-串联质谱法检测蜂蜜中硝基咪唑类药物残留具有高效、准确的优势，但是大多数文献中使用了SPE柱法净化，而SPE柱在蜂蜜样品净化过程中容易发生堵塞，降低样品质量又达不到国标检出限，且受SPE柱生产厂家、环境及洗脱溶剂的影响，SPE柱存在化合物丢失严重、检测结果重复性差、费时费力，且成本较高[2-6]的问题。本文采用LC-MS法快速测定蜂蜜中甲硝唑、地美硝唑和洛硝哒唑，在提取液中加入少量甲醇溶液，再用乙酸乙酯进行萃取，增加化合物在乙酸乙酯中的溶解度，也能起到破乳的作用，并通过盐析作用，使有机层和水层进行较大程度的分离，达到净化目的，不使用SPE柱净化也可以达到LC-MS的检测要求。

1  实验部分

1.1 试剂及仪器

试剂：甲醇、乙酸乙酯、乙腈（色谱级，安普公司）；纯净水由MilliborMilli-Q超纯水机制得；标准品MNZ（农业部农产品质量标准研究中心，100mg/L）、DNZ（北京百灵威科技有限公司，纯度≥97%）、RNZ（北京坛墨质检，纯度≥99.7%）。

仪器：美国waters Acquity TQD液相色谱-质谱联用仪，湖南湘仪公司H2050R型4000 r/min离心机、IKA HB 10型旋转蒸发仪、IKA涡旋混合器。

1.2 标准工作液制备

MNZ标准溶液储备液制备：准确移取浓度为100 μg/mL的MNZ标准物质1.0 mL，移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻线，浓度为10 mg/L，摇匀，-18 ℃保存。

DNZ标准溶液储备液制备：准确称取DNZ标准物质0.0010 g，20 mL甲醇超声溶解，移至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻线，浓度为10 mg/L，摇匀，-18 ℃保存。

RNZ标准溶液储备液制备：准确称取RNZ标准物质0.0010 g，20 mL甲醇超声溶解，移至100 mL容量瓶中，甲醇定容至刻线，浓度为10 mg/L，摇匀，-18 ℃保存。

MNZ、DNZ、RNZ混合标准溶液中间液制备：准确移取MNZ标准物质、DNZ储备液和RNZ储备液用甲醇配制成浓度分别为0.1 μg/ mL、0.2 μg/ mL、0.2 μg/ mL的混合标准溶液，待用。

MNZ、DNZ、RNZ混合基质标准溶液工作液制备：准确移取混合标准溶液中间液，用空白基质溶液分别配制成甲硝唑浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L和地美硝唑、洛硝哒唑浓度为1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg/L的混合基质标准溶液工作液。

1.3 样品制备

准确称取样品5 g至50 mL离心管中，加入5 mL水，涡旋5 min至完全溶解，加入1 mL甲醇，继续混合3 min，再加入2 g NaCl和20 mL乙酸乙酯，振荡10 min，充分萃取，4000 r/min离心5 min，移取全部上层清液，40 ℃下旋转蒸发至干，用1 mL乙腈-水（1:9）混合复溶，过0.22 μm有机滤膜，供LC-MS上机使用。

1.4 仪器条件

液相条件：色谱柱，美国ACES C18（ 2.1×150 mm，1.7 μm）；流速，0.20 mL/min；进样量，10 μL；流动相条件，A-水（2 mmol/L乙酸铵，0.1%甲酸）B-乙腈，0～1 min，20% B,1～2.0 min 20% B～80% B,2～2.5 min 80% B,2.5～3 min 80% B～20% B,3～5 min 20% B。

质谱条件：电离源及方式，ESI（+）；离子源电压，0.5 KV；脱溶剂温度，650 ℃；脱溶剂气流速，1000 L/h；锥孔气流速，50 L/h；扫描方式，多反应监测（MRM）；各化合物定性、定量离子对、锥空电压及碰撞能量见表1。

2  结果与讨论

2.1 样品提取条件的选择

蜂蜜中主要成分为果糖、蔗糖、葡萄糖，水溶性强，而硝基咪唑化合物易溶于甲醇和乙酸乙酯，若直接用甲醇或乙酸乙酯提取，则蜂蜜呈坨状且不会分散，提取液不能进入蜂蜜内部进行提取，提取效果极差，所以需将蜂蜜用水溶解，在用乙酸乙酯进行萃取[7]。

2.1.1 溶解条件选择

提取过程中出现水相和有机相之间经常会出现较厚的“乳化层”，加盐不能去除，且影响化合物最终的回收率[8-9]，因此考虑加入适当体积的甲醇，尝试破除乳化层，效果明显，讨论加入甲醇体积，乳化层厚度，在相同蒸发温度、真空度及转速条件下的浓缩时间以及回收率结果，确定提取条件见表2。

结果表明，当不加入甲醇时中间层厚度较厚，且DNZ和RNZ提取效率不理想，当加入甲醇体积为1 mL时，乳化层完全去除，且三个化合物的回收率均为所有试验数据的最高值，均在85%以上，回收率较高，当加入甲醇量为3、5、8、10 mL时，乳化层逐渐消失，提取效率也逐渐降低，浓缩速度也逐渐减慢，影响实验进程。在实验过程中发现，随着甲醇加入量逐渐增多，提取液中出现絮状沉淀物也越多，原因是有机相比例增多，碳水化合物溶解度降低。

2.1.2 乙酸乙酯萃取次数选择

确定溶解条件，将样品用乙酸乙酯分别萃取1次和2次，结果表明，萃取结果基本一致，不需二次萃取。

2.2 检出限和回收率、精密度

2.2.1 检出限

由于蜂蜜基质的存在，电离存在基质抑制的情况，所以采用不含有MNZ、DNZ、RNZ的阴性基质提取液作为溶剂，做标准溶液工作曲线，以化合物浓度X（μg/L）为横坐标，峰面积Y为纵坐标[10]，线性关系曲线见表3。

结果表明，称样量为5 g，定容体积为1 mL时，以3倍信噪比（S/N）为检出限，则MNZ、DNZ、RNZ检出限分别为0.1 μg/kg、0.2 μg/kg、0.2 μg/kg。

2.2.2 回收率和精密度

向不含有MNZ、DNZ、RNZ的5 g阴性样品中加入不同添加水平的三个化合物，涡旋、超声辅助混匀，再进行前处理进样，以阴性样品溶液作为溶剂，做标准溶液工作曲线，讨论加入不同添加水平的标准溶液时，化合物的回收率和精密度见表4。

2.3 实际样品检测

应用本方法对64个不同生产厂家和批次的枣花蜂蜜样品进行检测，其中MNZ有4个样品检出，检出率为6.25%，含量为0.14～0.47 μg/kg。地美硝唑有5个样品检出，检出率为7.81%，含量为0.53～2.83 μg/kg。洛硝哒唑无检出。检测结果及典型样品谱图见表5和图1。

3  结论

本文建立了以外标法定量，LC-MS法快速检测蜂蜜中甲硝唑、地美硝唑、洛硝哒唑的方法，该方法虽然在去除杂质方面相比SPE净化法有所欠缺，但时间短、准确度高、操作简单，大大节省了检测成本，并且在应对检测大量样品时，检测方法的参数能够满足国标检测要求，为检测蜂蜜中兽药残留提供了技术支持。

表1 MNZ、DNZ、RNZ质谱参数

表2 甲醇体积、乳化层厚度、浓缩速率以及回收率

表3 线性范围、线性方程、相关系数

表4 MNZ、DNZ、RNZ添加水平、回收率和精密度（RSD）（n=6）

表5 46批蜂蜜样品中典型样品测定结果

图1 MNZ、DNZ、RNZ的选择离子总离子流图

参考文献

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