陈丽萍1闫占鹏2刘美丽2赵高岭2丁元明1*汪斌3王萍3

摘要目的 通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术，对松茸、姬松茸、金耳、银耳、竹荪、榛蘑等常见食用菌进行蛋白图谱分析，探索MALDI-TOF-MS在大型食用菌鉴定领域的应用方法。方法通过甲酸提取法、液氮甲酸法、甲酸超声破碎法、液氮甲酸超声破碎法4种前处理方法分别获得菌菇样本的蛋白提取液；经MALDI-TOF-MS采集样本指纹图谱，对不同方法及不同样本的指纹图谱进行对比分析与聚类分析。结果通过方差分析发现不同方法对指纹图谱蛋白峰总量影响不显著，P=0.753＞0.05；但液氮甲酸方法获取的菌株指纹图谱平均特异峰数量最高为3.75个/株，图谱质量最好，更适用于大部分食用菌的前处理，同时发现云南省香格里拉县、四川省稻城县两地的松茸之间无法通过指纹图谱区分，表明此两地松茸含有相近的蛋白质组成。结论MALDI-TOF-MS技术在大型食用菌甄别鉴定中具有开发运用前景。

关键词 大型食用菌；鉴定；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）

Application of MALDI-TOF-MS Technology in Identification of Large-scale Edible Fungi

CHEN Li-Ping1YAN Zhan-Peng2LIU Mei-Li2ZHAO Gao-Ling2DING Yuan-Ming1*

WANG Bin3WANG Ping3

AbstractObjective To explore the application of matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massspectrometryMALDI-TOF-MS in the identification of large-scale edible fungi by analyzing the protein profiles of common edible fungi such asTricholoma matsutake(S. Ito  S. Imai) Singer,Agaricus blazeiMurr,Tremella fuciformis Berk,Lentinus edodes(Berk.)Sing,Naematelia aurantialba(Bandoni  M. Zang) Millanes  Wedin,Dictyophora indusiata(Vent.ex Pers) Fisch andArmillaria mellea (Vahl) P. Kumm.MethodsThe edible fungus protein samples were extracted and obtained by four pretreatment methods: formic acid extraction method, liquid nitrogen formic acid method, ultrasonic formic acid crushing method, and liquid nitrogen formic acid ultrasonic crushing method, respectively. The fingerprint of samples was collected by MALDI-TOF-MS, and the fingerprint of different methods and samples were compared and cluster analyzed.ResultsThrough analysis of variance, it was found that different methods had no significant effect on the total number of protein peaks in the fingerprint, P = 0.753 ＞ 0.05; but the average number of specific peaks of the fingerprints of the strains obtained by the liquid nitrogen formic acid method was 3.75 per plant, and the quality of the map was the best It is more suitable for pretreatment of most edible fungi. At the same time, it is found that theTricholoma matsutake(S. Ito  S. Imai) Singer from Shangri La County Yunnan Province and Daocheng County Sichuan Province cannot be distinguished from each other by fingerprints, indicating that the mushrooms in these two places contain similar protein composition.ConclusionMALDI-TOF-MS technology has a bright future in the identification of large-scale edible fungi.

Keywords Large-scale edible fungi; identification; matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF- MS)

基金项目： 特色高值农产品新型甄别检测关键技术研究NO. 2017YFF0211300；特色高值农产品真伪和身份精准甄别技术研究NO.2017YFF0211301

第一作者：陈丽萍(1981-)，女(汉族)，昆明人，高级工程师，从事食品安全检测及品种鉴定E-mail: 55490875@qq.com

*通讯作者，丁元明(1963-)，男(汉族)，湖北人，正高二级研究员，从事物种鉴定，E-mail: 1583695848@qq.com

1.昆明海关技术中心  云南昆明 650200  2.安图实验仪器(郑州)有限公司 河南郑州 450001  3. 昆明海关技术中心大理分中心  云南大理 671000

1. Kunming Customs Technology Center, Kunming 650200, Yunnan  2. Autobio Labtec Instruments Co., Ltd, Zhengzhou 450001  3. Dali branch of Kunming Customs Technical Center, Dali  671000, Yunnan

食用菌是一类含有高蛋白、低脂肪、多种维生素和微量元素的可以食用的蕈菌，含有多种活性功能物质（多糖、活性多肽、核苷类和三萜类等），此类活性功能物质在抗肿瘤、增强免疫力、调节血脂、降血糖、保肝解毒等方面发挥着重要作用[1-5]。随着人们生活水平的不断提高, 食用菌因其无公害、健康、安全的食用性质而越来越受欢迎, 正是由于其巨大的市场价值，某些不法商贩以次充好、鱼目混珠，将低价值的菌种经过包装充当高价值产品售卖，因此食用菌物种鉴定对其产品质量控制及国内外市场贸易规范至关重要[6]。

当前，关于食用菌的快速鉴定研究没有引起足够的重视，依然停留于依靠分子生物学手段结合菌体的形态学特征（菌盖颜色、形状、大小；菌柄的长度、形状等）进行菌种的分类[7,8]。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）因其分辨率、灵敏度、准确性高的特点，已被广泛应用于临床微生物的鉴定研究[9,10]，也为其在食用菌鉴定领域的应用提供了可能。MALDI-TOF-MS基于微生物蛋白质指纹图谱进行菌株鉴定[11]，由于食用菌为多细胞生物、细胞结构较细菌结构复杂，蛋白指纹图谱较难获取[12,13]，本研究针对使用4种前处理方法分别对松茸、姬松茸、香菇、竹荪、银耳、金耳等7种12株常见食用菌冻干品进行处理，探索MALDI-TOF-MS在食用菌鉴定领域的应用方法。

1  材料与方法

1.1 材料与试剂

松茸、香菇、竹荪、银耳等7种12株菌菇样本购买于云南省木水花野生菌农贸市场，均由中科院昆明植物研究所进行物种鉴定后作为本研究样品，其中松茸样本6株，来自于两个地域，其余菌菇样本各一株，详细信息见表1。

质谱样品处理基质溶液（郑州安图实验仪器有限公司），液氮，甲酸（aladdin公司）、乙腈（sigma公司）。

1.2 仪器与设备

Autof ms1000全自动微生物质谱检测系统  安图实验仪器（郑州）有限公司；sartorius 1-14离心机  sigma aldrich 公司；KQ-100KDE超声波清洗器  昆山超声仪器公司；微量移液器  Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 前处理方法

方法A（甲酸提取法）：取8~125 mm2菌菇干品粉碎后转入1.5 mL离心管中；加入30~60μL的70%甲酸溶液吹打混匀，加入等体积的乙腈，13000 rpm/min离心1 min，取上清。

方法B（液氮甲酸法）：取8~125 mm2菌菇干品放入研钵中，加入适量液氮反应30 s±5 s，将菌菇干品碾碎转入1.5 mL离心管中；加入30~60μL的70%甲酸溶液吹打混匀，加入等体积的乙腈，13000 rpm/min离心1 min，取上清。

方法C（甲酸超声破碎法）：取8~125 mm2菌菇干品粉碎后转入1.5 mL离心管中；加入30-60μL的70%甲酸溶液吹打混匀后加入等体积的乙腈，超声破碎4 min，功率90%，13000 rpm/min离心1 min，取上清。

方法D（液氮甲酸超声破碎法）：取8~125 mm2菌菇干品放入研钵中，加入适量液氮反应30 s，将菌菇干品碾碎转入1.5 mL离心管中；加入30~60μL的70%甲酸溶液吹打混匀后加入等体积的乙腈，超声破碎4min，功率90%，13000 rpm/min离心1 min，取上清。

1.3.2 质谱分析

(1)吸取1 μL处理好的菌菇蛋白提取液滴加到Anchorchip靶板上，自然风干，覆盖1 μL基质溶液，完全干燥后放入质谱仪器中，进行检测，质谱检测前校准仪器。

(2) Autof ms1000仪器参数设定：Autof ms1000设定：推斥极电压20 kV，激光频率60 Hz，质量范围0~15000，采集卡延时230 ns，激光强度35%~45%。

1.3.3 图谱分析

采集样品图谱，使用Autof Acquirer对菌菇图谱峰的信息进行分析，使用Autof Analyser对菌茹图谱进行对比与聚类分析。

2  结果与分析

依照上述方法对菌菇进行处理，通过Autof Acquirer软件对图谱进行分析，统计4种方法菌菇的蛋白提取的图谱峰数量、图谱质量等信息，分析前处理方法优劣势、影响因素及在鉴定领域的应用价值。

2.1 不同方法采集图谱信息统计

质谱图谱峰数量与特异峰数量是图谱质量的重要指标，也是质谱仪区分菌株重要考量条件，因此对通过不同前处理方法收集的图谱信息进行统计（见表2）。对通过4种方法获取的图谱蛋白峰总量进行方差分析，发现组间F=0.401＞0.05，P=0.753＞0.05，表明不同前处理方法获得的图谱峰数量无显著差异；对4种前处理方法获取的图谱特异峰总量进行方差分析，发现组间F=2.931，P=0.044＜0.05，表明4种前处理方法对获取的图谱特异峰数量有显著影响，方法B特异峰数量均值3.75个/株高于方法A、C、D特异峰均值1.75个/株、2.33个/株、3.25个/株，特异峰数量占总蛋白峰数量比重直接影响仪器区分菌菇的性能，因此，方法B理论上更适合作为大型菌菇的质谱鉴定前处理方法。

同时，我们发现姬松茸在经过4种方法提取后，只有方法D可以获取一定数量的总峰量与特异峰数量，原因可能是姬松茸细胞壁结构更为复杂，需要经过足够的物理或化学破坏手段才能获取蛋白信息，同样的问题在香菇的处理结果中也可看出，仅有方法C可获得具有足够蛋白信息的图谱。因此针对此类特殊菌菇，应采用具有针对性的前处理方案，才能获取满足需求的指纹图谱，如图1,采用不同方法采集不同菌菇指纹图谱，图谱以“样本编号-方法代号”的方式命名。

2.2 不同方法采集图谱对比

质谱仪能够在临床微生物领域达到鉴定目的基于样品指纹图谱和数据库的匹配程度，因此在大型食用菌鉴定方面，数据库的构建同样是识别菌菇的前提。数据库构建所需图谱质量要求严格，除峰数量、特异峰数量外，对图谱基线平稳度、蛋白质荷比宽度等都有严格的要求，以银耳（SN-5）和金耳（SN-8）为例，我们对通过不同方法获取的菌菇图谱进行比对（见图2、图3），发现0-15000 m/z范围绝大多数食用菌蛋白峰可以被检测到，图2中从特异峰数量看4种方法在m/z=4242.4位置有1个共有特异峰，方法B较其余方法多2个特异峰3351.4和8866.8，表明方法B在获取菌菇质谱图谱方面更具有优势；从基线看方法B基线较其他3种方法更为平稳（整体基线强度均低于0.2），更适用于数据库建立。图3中经过4种方法提取蛋白后的质谱图谱只有一个共有特异峰m/z=4868.8，方法B具有m/z=2523.5、4474.3、4750.2、7307.7、11606.7共计5个较其他前处理方法多出的一些特异峰，更直观更容易辨认，表明方法B用作大型食用菌质谱前处理方法较好。

2.3 指纹图谱聚类分析

将采用方法B获取的指纹图谱通过Autof Analyser软件进行聚类分析，图谱以“样本编号-方法代号”的方式命名，结果如图4所示，从图中可以看出：样品SN-4、SN-5、SN-6、SN-7、SN-8、SN-9分别单独归类，表明样本之间可以通过图谱与其他样品辨别；样品SN-1、SN-2、SN-3、SN-10、SN-11、SN-12被归为一类，即来自于云南省和四川省两个产地的6株松茸具有相似的蛋白指纹图谱，表明来自于四川和与云南两个省份的松茸样本具有相似的蛋白质组成。

3  讨论

全球已知的可形成大型子实体或菌核组织的真菌有6000余种，其中可供食用的有2000多种。中国地域辽阔，已发现食用菌达到966种[14]，部分菌种已实现大规模产业化种植，因其营养全面、味道鲜美，市场潜力巨大，需求量逐年上升，已成为中国重要的种植业产业项目之一[15]。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是20世纪80 年代末问世并迅速发展起来的一种质谱分析技术，它不仅使得传统的主要用于小分子物质研究的质谱技术发生了重大变革，同时给医学领域、生物领域，尤其是给临床微生物检验领域甚至菌株耐药性评定等领域带来了新的思路与方向[16-19]。蛋白质在生物体中起着至关重要的作用，参与各种生命活动的代谢和调控过程，是部分基因表达的最终产物，由于生命体基因序列的差异，各个生命体所包含的蛋白数量与种类各不相同，MALDI-TOF-MS技术基于不同种微生物蛋白质指纹图谱完成微生物的鉴定[20-22]；不同种的食用菌具有不同的核糖体蛋白，常见新鲜食用菌子实体形态结构不同，通过肉眼识别能够区分[23]，但经后期加工的食用菌制品不容易通过肉眼进行分辨。另外，一些毒菌与食用菌新鲜子实体外形相似，不宜区分，这是误食食用菌造成食物中毒的主要原因。对于这些情况，传统的方法运用ITS测序进行种属分类鉴定,也有运用红外光谱对食用菌鉴定进行的相关研究[24,25]，然而真菌ITS测序耗时久、检测成本高，红外光谱不适于痕量物质的测定且建模难度大易产生偏差，大型食用菌检测领域，未见基于MALDI-TOF-MS的相关报道，而基于质谱技术的分类学方法可能为此提供一种新的食用菌鉴定思路。

本次研究基于MALDI-TOF-MS技术，对常见大型食用菌鉴定领域的应用方法进行了相关研究，通过使用甲酸提取法（方法A）、液氮甲酸法（方法B）、甲酸超声破碎法（方法C）、液氮甲酸超声破碎法（方法D）分别对常见食用菌松茸、姬松茸、银耳、香菇、竹荪、金耳和榛蘑进行了核糖体蛋白提取，对MALDI-TOF-MS技术应用于大型食用菌鉴定领域的可行性及前处理方法适用性进行了探究。

通过方差分析发现：不同方法对获取的指纹图谱蛋白峰总量影响不显著，P=0.753＞0.05；另一方面，液氮甲酸方法获取的菌株指纹图谱平均特异峰数量最高，为3.75个/株，特异峰数量是菌株识别成功率的决定性因素，因此液氮甲酸法更适用于食用菌的前处理及建库操作过程。通过对银耳和金耳的图谱分析发现液氮甲酸方法可以获取更多的特异峰，整体基线高度低于0.2；液氮甲酸的方法和甲酸超声破碎方法对金耳的蛋白提取效果相近，说明某些食用菌可能不止适用于一种前处理方法，在对食用菌进行提取时应结合实际灵活选择。聚类分析中显示不同种食用菌指纹图谱可以相互区分，但是同种食用菌及不同地域同种食用菌指纹图谱之间可以相互匹配，聚类分析难以区分，这与运用DNA指纹图谱的方法无法区分金沙江以北的云南地区和四川地区的松茸结果一致[26]。值得考虑的是，云南香格里拉县和四川省稻城县的松茸生长地地理位置接近、环境气候差异不明显，可能两地的松茸具有相似或相同的蛋白质，地理跨度大的不同生长环境的同种食用菌是否可以应用质谱技术完成区分，还需进一步研究验证[27]。

结合本次研究的结果来看， MALDI-TOF-MS可以应用于食用菌检测领域，从样本取样、前处理到上机检测，一个样品的鉴别时间不到20分钟，且不同种的食用菌具有明显不同的特征指纹图谱，这便为基于MALDI-TOF-MS的食用菌的鉴定提供了理论依据。MALDI-TOF-MS的鉴定的核心是数据库，基于本次研究所取得结论，可以继续收集大量的食用菌标本，采用合适的前处理方法提取其核糖体蛋白后，通过MALDI-TOF-MS进行食用菌数据库的构建，这将会在食用菌鉴定领域中发挥重要作用。

表1 样本信息

Table 1 Sample information

表2 图谱信息统计

Table2 Information of Mass spectrum

图1 不同方法采集的食用菌指纹图谱

Fig.1 Fingerprints of edible fungi collected by different methods

图2 不同前处理方法银耳（SN-5）图谱对比

Fig.2 Comparison of different pretreatment methods forTremella fuciformis Berk(SN-5)

图3 不同前处理方法金耳（SN-8）图谱对比

Fig.3 Comparison of different pretreatment methods forNaematelia aurantialba

(Bandoni  M.Zang) Millanes  Wedin（SN-8）

图4 液氮甲酸法（前处理方法B）获取图谱聚类分析

Fig.2 Cluster analysis of spectra obtained by liquid nitrogen formic acid method(Pretreatment method B)

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