湛嘉1朱海强2王园2范春蕾2杨燕2李露青2曹国洲1陈先锋1

摘要 本文建立了典型动物食品——猪肉中50种常用的强极性-极性有机小分子污染物快速简便的检测方法。采用含EDTA的沉淀剂和正己烷，一步完成主要的提取和净化。以七氟丁酸作为离子对试剂，反相C18柱保留，UPLC-MS/MS电喷雾正离子模式下分析。一步法前处理能充分去除干扰物，特异性好。定量检测限范围在0.05 ~ 20 μg/kg。在猪肉中三个添加水平的平均回收率范围在70.4~125.0%，相应的重复性范围在1.7~33.7%之间，日间精密度在2.0～28.5%，基本符合欧盟2002/657/EC相关规定。

关键词 强极性污染物;极性污染物;动物源性食品;超高效液相色谱-串联质谱联用

Generic and Rapid Determination of Stronger Polar to Polar Organic Chemical Contaminants in Pork by Using Ultra-performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

ZHAN Jia1ZHU Hai-Qiang2WANG Yuan2FAN Chun-Lei2YANG Yan2LI Lu-Qing2

CAO Guo-Zhou1CHEN Xian-Feng1

Abstract A universal, rapid and simple analytical method able to identify stronger polar to polar contaminants in pork was developed. For quantification, matrix-fortified calibration curves were performed to compensate the matrix effect and loss in sample preparation. For most of the target analytes, there was no significant interference on analysis by using one-step pretreatment process. The limit of quantification (LOQs) varied from 0.05 to 20 μg/kg. Average recovery rates of the spiked standards in pork were in the range from 70.4% to 125.0% with associated RSD values from 1.7% to 33.7% under the selected conditions. The inter-day precision were in range of 2.0-28.5%, which were acceptable and in agreement with the criteria of Commission Decision 2002/657/EC.

Keywords Stronger polar contaminant; polar contaminant; animal food; Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

前言

随着分析科技的发展尤其是色谱-串联质谱联用技术的进步，大量研究者开发了在同一个方法中甚至可能同时包含兽药、农药、生物毒素、环境污染物、食品添加剂和非法添加物等理化性质不同的几十个类别以上、多达数百种目标化合物，有的方法甚至成为了行业、国家或国际标准方法。然而，这些方法几乎不涉及强极性（即强水溶性）的目标物[1-5]。强极性的农药（如草甘膦等除草剂、矮壮素等植物生长调节剂）和兽药（如氨基糖苷类、多肽类抗生素）在实际生产中是切切实实被大量使用，在种养殖上扮演着非常重要的角色。虽然这些化合物普遍低毒，且在生物体内蓄积率较低，但也易被不规范使用而导致超标，带来食品安全风险。

强极性的目标物检测，无论前处理、色谱保留甚至质谱分析等方面，均具有高度的复杂性[6]。目前，一般采用单残留、一类或少数几项同时分析，长期滞后于食品的自查和监管需求，成为食品安全监管的一个特别容易忽视的盲区。究其原因主要有以下几点：一方面，这些强极性物质极强的水溶性，几乎不能保留在反相色谱柱上，有的通过离子对试剂保留，有的通过HILIC保留，有的则需要衍生或酸碱两性柱子保留；另一方面，这些物质几乎不溶于有机溶剂，不能通过有机溶剂沉淀蛋白提取强极性化合物，大都需要含水量超过50%的提取液，这样提取复杂食品基质，往往带来大量蛋白、糖分、盐分、多酚类等干扰物，尤其是动物肌肉内脏、饲料、茶叶，导致极强的基质效应；其三，部分强极性目标物对pH和热敏感，稳定性差，冗长的前处理可能导致过高的损失率；其四，部分强极性目标物（如氨基糖苷类）易被金属阳离子所吸附，甚至被玻璃、塑料等器皿所吸附。

另外，在极性化合物中，四环素类和喹诺酮类虽然能在普通C18反相色谱柱上较好保留，但在浓度较低情况下，易吸附到基质中Ca2+、Mg2+等金属阳离子上，造成回收率的低下，必须采用含有EDTA鳌合剂的水相提取液[7]，常规多类别多残留分析方法前处理往往缺乏此步骤。β-内酰胺类抗生素则稳定性较差，对水、pH和热均不稳定，前处理的酸碱性和温度需要控制，且越简便快捷越好，有的种类如阿莫西林、头孢氨苄等，甚至很难溶于纯的乙腈中，很难通过常规的多类别多残留分析。从文献报道来看，LC-MS/MS是分析食品中强极性和极性目标物的使用频率最高的检测手段，具有出色的特异性、通用性和选择性[7,9]。为此，我们充分利用强极性和极性目标物之间的共性，成功开发了强极性-极性通用的前处理方法及其LC-MS/MS分析方法，通过猪肉进行了方法验证取得满意的效果，旨在建立完善系统的食品快速筛查体系，减少漏检，以适应高效食品安全自检和监管需要。

1  实验部分

1.1 化学品和试剂

标准物质购自Sigma-Aldrich, Dr. Ehrenstorfer， Witega和EU pharmacopoeia等公司。根据各自的溶解性质和纯度，氨基糖苷类、奥它韦司、强极性农药（杀螟丹、氨基吡啶酸、百草枯）等用乙醇-水(30:70, v/v)配制成0.5 mg/mL。其他用乙腈-乙醇(50:50, v/v)或乙腈-二甲亚砜(50:50, v/v)，配制成500 mg/L。用移液器吸取适量的各单标，用乙醇定容，使强极性农药、氨基糖苷类、四环素类、β-内酰胺类浓度为1000 ng/mL，三聚氰胺和双聚氰胺类为2000 ng/mL，其余均为200 ng/mL的标准工作溶液（见P53表1），-18℃冷藏，标准工作溶液更新时间不超过2个月。乙腈和其他流动相涉及的试剂由美国天地公司提供（HPLC级别），其他试剂均为国产分析纯，水通过Milli-Q纯水仪(Millipore)纯化得到，极性目标物沉淀剂(Supertech Polar Precipitation Agent C，cat.# 55251-1c)购自浙江哈迈科技公司。

1.2 样品

所有猪肉样品从宁波市当地的菜市场和超市购买。选取有代表性的100 g样品用厨用搅肉机粉碎，4℃冷藏。

1.3 前处理

称取的粉碎后的猪肉样品5 g(精确到0.01 g)置于50 mL刻度离心管中，加入20 mL极性目标物沉淀剂（Supertech Polar Precipitation Agent C，cat.# 55251-1c）和正己烷10 mL，以20000转/min匀浆3 min，涡旋混合5 min，在0℃下，以4500 r/min离心10 min，下层清液经脱脂棉过滤器到15 mL刻度试管中，刚好到3 mL刻度线，在40℃水浴中氮吹至2.0 mL以下，加水至2.0 mL刻度线，经0.2 μm尼龙滤膜过滤至2 mL自动进样器样品瓶中，供LC-MS/MS测定。

1.4 UPLC-MS/MS 分析

色谱柱为Acquity Waters HSS-T3 C18（2.1 mm ×100 mm, 1.8 μm）；柱温：45℃；流动相A和B分别为：甲醇（含甲酸0.1% (v/v)和水（含七氟丁酸50 mmol/L）。流速：0.25 mL/min；梯度洗脱条件为(t in min): t 0～0.4, A = 0%; t 8.5～10.4, A = 100%; t 10.5, A = 0%，保持2.5 min；流路切换：0~2.5 min和10~13 min 切换阀打开，色谱柱流出液进入废液，2.5 min~10 min期间进行质谱采集。通过多反应监测(MRM) 进行数据采集，正离子模式毛细管电压分别为3.5 kV，离子源和去溶剂气温度分别为150和500℃；去溶剂和锥孔流速：900和150 L/h；碰撞气体：氩气：4×10-3mba。

1.5 方法验证

在5.00 g空白样品中分别加入混合标准溶液0、25、50、100、200、400、1000 μL标准溶液，静置15 min后，按上述前处理方法进行处理后，以浓度为横坐标，响应值为纵坐标，做基质添加标准曲线用来定量。

为了考察潜在的干扰峰，对15个不同的空白样品进行前处理并分析。以10倍信噪比作为定量检测限[3,6]。在5.00 g空白样品中，加入混合标准溶液0、5、10、25、50 μL，以信号大于10倍基线噪音确定最低定量限。在5.00 g空白样品中加入混合标准溶液100、200和400 μL，按上述前处理方法处理后进行测定，每个水平重复6次，测定三个添加水平的回收率和精密度。连续6天，在5.00 g样品中添加200 μL混合标准溶液，来计算批间精密度。

2  结果与讨论

2.1 前处理方法——双相提取净化法

强极性化合物的提取具有特殊的共性。其一，水溶性极强，不溶于有机溶剂。其二，易与金属阳离子结合，造成回收率低下。对于氨基糖苷类、杀螟丹等化合物属于水溶性极强的药物，在有机溶剂和较高有机相含量的水溶液均难溶，一般采用水、5%三氯乙酸水溶液、磷酸缓冲液等提取[10]。然而，这些常用提取液的沉淀蛋白的效果较差，而采用亚铁氰化钾-乙酸锌或5％高氯酸溶液，回收率差。EDTA溶液可以结合样品基质中的Ca2+、Mg2+等金属阳离子，这对氨基糖苷类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类抗生素非常必要，尤其在低含量的时候，缺乏EDTA的螯合金属离子的情况下，这些目标物的回收率甚至为0，如图1所示，四环素类和氨基糖苷类添加10 μg/kg，喹诺酮类添加2 μg/kg，不同程度被吸附，回收率低下，尤其是四环素类回收率几乎为0。因此，EDTA的参与提取步骤是非常必要的。

极性目标物沉淀剂C(Supertech Polar Precipitation Agent C)由乙酸铵缓冲液和EDTA溶液、乙腈、乙醇和二甲亚砜等组成。其中，乙酸铵缓冲液中的水含量不仅能保障对极性待测物提取效率，而且具有一定沉淀蛋白作用。同时，EDTA起到螯合金属离子作用。另外，乙腈等有机溶剂增强沉淀效果，且在一定的添加水平内，有机溶剂的部分参与，并未发现包括氨基糖苷类等强极性目标物的回收率有明显降低。与此同时，正己烷发挥高效去脂作用，主要提取和净化过程几乎一步完成，大大减少了前处理步骤，提高了方法重复性。氮气吹扫下，除去有机溶剂，不仅可以起到浓缩的作用，而且可以消除溶剂效应，获得更好的峰形。随着提取物内的有机溶剂减少，并没有观察到沉淀物出现，也证明了前一步骤的沉淀净化效果十分良好。我们对比了采用50%乙腈提取，去除有机溶剂后，会出现浑浊，净化效果明显不如极性目标物沉淀剂C。由于缺乏固相萃取（SPE）步骤，通过设定0～2.5 min柱流出液进入废液，可以避免提取液中盐分和样品中的碳水化合物污染质谱离子源。

从相关文献报道来看，Gaugain等亦将四环素类、氨基糖苷类、林可霉素类和喹诺酮类与青霉素类、头孢类、大环内酯类和磺胺类分成两组，分别用5%三氯乙酸和乙腈提取[11]，Lopez等检测蜂蜜中链霉素不能通过反相小柱净化，否则回收率为0[12]，Kauffmann等也有类似观点[7]。与这些方法相比，本方法操作简便快捷，样品通量高。同时，这些研究均指出了强极性化合物前处理的特殊性，也充分印证了若要涉及这些强极性目标化合物，极性分组前处理是非常必要的。

2.2 色谱条件和质谱条件的优化

2.2.1 色谱条件的优化

强极性化合物如氨基糖苷类、奥司它韦、氨基吡啶酸等药物，在反相液相色谱柱上几乎不保留。目前有两类方法用于保留强水溶性化合物。其一，采用HILIC正相色谱柱（即为反反相保留模式），与硅胶、氨基、Amide等色谱柱相比，两性HILIC对氨基糖苷类的保留效果最佳[13]。由于这种模式出峰时间往往集中在1～3 min，与主要基质出峰的时间极为接近，无疑对前处理的要求会很高，对于低含量的待测物分析是十分困难的，一般不能缺少离子交换等固相萃取净化步骤；其二，在流动相中添加三氟乙酸、五氟丙酸、七氟丁酸等挥发性较强的离子对试剂，氨基糖苷类化合物与之形成离子对结合后极性降低，在反相色谱柱可以得到保留。这种模式目标物的出峰时间一般较长，一般与主要基质干扰物出峰时间错开，对前处理要求相对前者低很多。除此之外，还可以和四环素类、喹诺酮类、β-内酰胺类同时分析。从文献报道来看，也有同时测定的强极性和极性待测物类似报道。他们利用0.05 M的EDTA溶液和酸化乙腈（0.1%甲酸）提取婴儿配方奶粉中的氨基糖苷类、β-内酰胺类、四环素类、喹诺酮类、大环内酯类、磺胺类、驱虫药等150种兽药，LC-MS/MS最低检测限可达1～10 ng/g[14]。

根据前期研究优化结果，在流动相内添加50 mmol/L的七氟丁酸对增强氨基糖苷类等强极性碱性目标物的保留为最佳[15]。与含0.1%甲酸的水-甲醇体系流动相相比，离子对试剂改变了四环素类、β-内酰胺类等极性目标物在反相色谱柱上的色谱行为。例如，三聚氰胺、阿莫西林的保留得到明显增强，这对其分析定量十分有利。然而，四环素类与其相应的差向异构体尽管基本能分离开，不影响其定量，但其分离度与无离子对试剂的甲酸流动相相比，明显变差。

2.3 方法的有效性

2.3.1 选择性、线性和定量检测限

根据对15个空白猪肉样品的分析发现，在受试的50种强极性-极性目标化合物中，本方法基本能提供干净低背景的质谱图，没有发现明显的干扰峰，具有满意的选择性（见图2）。在线性范围内（喹诺酮类0.25~10 ng/mL，其余2.5~100 ng/mL），猪肉中相关系数R在0.9854～0.9990。除双聚氰胺外，其余均高于0.9900。

对于猪肉，奥司它韦定量检测限为0.05 μg/kg，喹诺酮类定量检测限0.1～0.5 μg/kg，四环素类定量检测限2.0 μg/kg，β-内酰胺类1.0～5.0 μg/kg，氨基糖苷类定量检测限在0.5~10.0 μg/kg，强极性农药为5.0 μg/kg。双聚氰胺和三聚氰胺分别为定量检测限20.0和10.0 μg/kg。以上基本满足欧盟和我国的限量要求。详细的线性、定量限见P53表1。

2.3.2 准确性和重复性

在猪肉中，三个水平的平均添加回收率在70.4%~125.0%。添加回收重复性和日间精密度范围分别为1.7%~33.7%和2.0%～16.0%，除双聚氰胺外，RSD均低于30%。这些表明了本方法准确性和重复性基本满足定量要求。详细的回收率、日内和日间精密度见P53表1。

2.4 实际应用

该方法被成功应用于在当地市场抽检的猪肉50份样品中。阳性样品共计15个，其中，金霉素（阳性1个，494.4 μg/kg）、土霉素（阳性4个，1.1～494.6 μg/kg）、四环素（阳性2个，2.78～16.2 μg/kg）、氧氟沙星（阳性3个，0.82～9.6 μg/kg）、恩诺沙星（阳性12个，0.95～382.3 μg/kg）。土霉素和恩诺沙星超过了欧盟和我国限量标准0.1 mg/kg。阳性样品经过欧盟2002/657/EC规定的4分制方法进行了确证。从药物类别来看，喹诺酮类、四环素类是检出频率较高的药物。

3  结论

通过在流动相中添加离子对试剂，本方法检测项目囊括了强极性-极性范围内的农兽药和非法添加物，仅通过简便快捷的一步式沉淀净化基本完成前处理，与固相萃取等复杂费时的传统方法相比，前处理方法省时省力，可满足动物源性食品高通量快速筛查要求。

第一作者：湛嘉,1977年生,博士，研究员，从事食品、化妆品安全检测与研究 Tel.: +86-18858088108/+86-574-87022691，Fax: +86-574-87123765，E-mail: zhanjia2000@163.com

1. 宁波检验检疫科学技术研究院，宁波，315012  2. 宁波中盛产品检测有限公司，宁波，315012 1. Ningbo Academy of Inspection and Quarantine, Ningbo 315012    2. Ningbo Zhongsheng Products Testing Co., Ltd , Ningbo 315012

本研究由宁波市创新团队课题2015C110018资助

图1 EDTA参与和缺少的情况下，添加氨基糖苷类、四环素类和喹诺酮类的回收情况

Fig.1 The comprison of the recovery of aminoglycosides, tetracyclines and quinolones spiked in pork with EDTA or without EDTA.

图2 添加在猪肉中来自强极性-极性目标物的典型MRM图谱（包括最早、最晚出峰以及难以分离的化合物）

Fig.2 Chromatograms of the most representative compounds from different class in the spiked pork sample.

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表1 猪肉中50种强极性-极性目标物中英文名称标准曲线斜率、回归系数、定量限、三个水平回收率及其变异系数、日间精密度

Tab.1 The retention time, slope linearity, LOQs, range of average recovery, repeatability and inter-day precision of 50 analytes in pork(n=6)