苏姗姗 姚志敏 赵光跃 林童 凤晓博 魏玉海

摘要 采用超高效液相色谱- 四极杆/静电场轨道阱质谱建立了具有提高缺氧耐受力功能的保健食品中那非类物质的测定方法。样品经甲醇提取，采用Waters Acquity UPLC BEN T3 色谱柱( 2.1 mm × 100 mm，1. 8 μm) 分离，0.1% 甲酸水溶液和乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱。采用Full MS /dd-MS2 扫描模式，结合精确分子质量数、保留时间和二级特征碎片离子对目标化合物进行筛查与确证。结果表明，90 种目标化合物在0.1 ~10 mg/kg 范围内线性关系良好（r2＞0.99）；定量限（LOQ）为0.01 ~5 mg/kg，回收率为61.8 % ~119.1 %，相对标准偏差（RSD）为1.2 % ~ 12.9 %。该方法简单、准确、快速，适用于具有提高缺氧耐受力功能的保健品中90种那非类物质的定性筛查和定量分析。

关键词 提高缺氧耐受力；保健食品；那非类物质；测定

Determination of Nafils in Health Care Products to Improve Hypoxia Tolerance in Plateau Area

SU Shan-Shan1,2YAO Zhi-Min1ZHAO Guang-Yue1

LIN Tong1FENG Xiao-Bo1WEI Yu-Hai1,2

Abstract An ultra-performance liquid chromatography–quadrupole/exactive orbitrap mass spectrometry was developed for determination of 90 nafils in health care products to improve hypoxia tolerance in plateau area．The samples were extracted by methanol, and separated on a Waters Acquity UPLC BEN T3（2.1 mm×100 mm,1.8 μm）column using a binary solvent system composed of 0. 1 % formic acid aqueous solution and acetonitrile solution by gradient elution．The analytes were precisely screened and confirmed with the precision mass，retention time and two-stage ion mass spectra in Full MS /dd-MS2scan mode．The result showed that good linear relationships for 90 analytes in range of 0.1-10 mg/kg（r2＞0.99）. The limits of quantitation (LOQ) were in range of 0.01-5 mg/kg, The recoveries ranged from 61. 8 % to 119.1 % with relative standard deviations (RSD) of 1. 2% - 12.9 %. The method was simple, sensitive and accurate, and was suitable for the rapid screening and confirmation of 90 nafils in health care products to improve hypoxia tolerance in plateau area.

Keywords Health care products; quadrupole - exactive orbitrap mass spectrometry; nafils; determination

随着对高原地区资源大规模的开发，以青海特色植物资源为基础研制的具有提高缺氧耐受力功能的保健品开发也成为热点。提高缺氧耐受力保健食品最常用的中药是红景天，尤其在青藏高原地区[1]。保健食品中非法添加化学药品现象在我国屡见不鲜，那非类磷酸二酯酶5（PDE5）抑制药物更是保健食品中非法添加的重灾区。PDE5最早用于抗肺动脉高压药物使用，在高原口服西地那非可降低低氧性肺动脉高压，可防治高原性疾病[2]。国内也有关于西地那非具有增强机体抗疲劳和抗氧化能力的报道[3-4]。目前，那非类PDE5抑制剂的主要检测方法如高效液相色谱法[5-8]、高效液相色谱-低分辨质谱联用法[9-14]、薄层色谱法[15]和高效液相色谱-高分辨质谱法[16-22]。

本研究基于UPLC-Q-Exactive 四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱建立了提高缺氧耐受力保健食品中90种那非类物质快速定性定量分析方法，为具有提高缺氧耐受力功能的保健食品中非法添加的监管提供了技术支撑。

1  实验部分

1.1 试剂与仪器

液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱（美国ThermoFisher公司）；DTC-27 型超声波清洗器（湖北鼎泰生化科技设备有限公司）。

乙腈、甲醇（色谱纯，美国默克公司）；水为超纯水（美国Milli-Q SP Regent Water system）；甲酸（色谱纯，美国西格玛公司）；29 种那非类物质混标A、29 种那非类物质混标B、29 种那非类物质混标C、3 种那非类物质混标均购自天津阿尔塔有限公司。

1.2 仪器条件

色谱条件：色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3 G (2.1×100 mm, 1.8 μm），流动相为乙腈（A）- 0.1 % 的甲酸水溶液（B）；梯度洗脱：0～8 min 5 % ~30% A，8～10 min 30 % A，10～18 min 30 %～50 % A，18～26 min 50 %～98 % A，26～28 min 98 % A，28～28.5 min 98 %～5 % A，28.5～30 min 5 % A；流速为 0.3 mL/min；进样量10 μL。

质谱条件：扫描模式为Full MS /dd-MS2，Full MS 分辨率70000，dd-MS2分辨率17500；扫描范围m/z 300～1100；碰撞能量20、40、60 eV；喷雾电压3.50 kV（正离子扫描模式）；离子传输管温度320 ℃；辅助气温度350 ℃；鞘气40 arb；辅助气10 arb。

1.3 样品的前处理

1.3.1 胶囊试样

取胶囊试样适量混匀，精密称取0.1 g（精确至0.0001 g）置于10 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声提取15 min，放冷至室温，用甲醇定容，转移至15 mL离心管中，10000 r/min离心5 min，上清液经微孔滤膜过滤，备用。

1.3.2 软胶囊试样

取软胶囊试样适量混匀，精密称取0.1 g（精确至0.0001 g）置于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯2 mL，振摇，使其分散，加甲醇适量，超声提取15 min，放冷至室温，用甲醇定容，转移至15 mL离心管中，10000 r/min离心5 min，上清液经微孔滤膜过滤，备用。

2  结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

90种那非类化合物中存在多组同分异构体，且具有很多相似的二级碎片离子，因此，实现目标物有效分离对定量非常重要。本研究考察了Waters Acquity UPLC HSS T3 (2.1×100 mm, 1.8 μm)和Waters C18(2.1×100 mm, 1.8 μm)色谱柱对目标物的分离效果，T3柱使目标物的色谱峰形更为尖锐对称，且对于大部分同分异构体均能达到有效分离，具有更高的柱效和检测灵敏度。同时，考察了甲醇、乙腈、水和0. 1%甲酸水4 种流动相对分析结果的影响。结果表明，采用甲醇- 0. 1%甲酸水可以提高待测物质的信号强度。经优化，确定了上述的色谱条件。

2.2 质谱条件的优化

本研究采用高分辨质谱的Full MS /dd-MS2扫描方式，对目标检测物进行定性筛查和确证，碰撞能量设为20、40、60 eV。结果表明，在正离子模式下，90 种目标化合物的准分子离子峰[M+H]+均能出现，且质量准确度误差均小于5 ppm，可满足定性定量需求。90 种那非类物质中有14 组同分异构体，通过保留时间和二级碎片质谱信息可确保定性筛查的准确性（如表1）。本方法采用母离子定量对90 种那非类物质进行定量分析，对于保留时间接近的同分异构体，采用子离子定量。目标化合物C 47 和C 62 为同分异构体，保留时间分别为13.05 min和12.97 min，采用母离子定量会有干扰，本方法利用化合物的二级质谱差异采用二级碎片离子进行定量（如图1），C 47采用二级离子m/z 283.11838作为定量离子，C 62的定量离子为m/z 297.13406。

2.3 方法学验证

2.3.1 方法的线性范围与检出限

在空白基质溶液配制标准曲线，按前处理方法处理后上机测定，以峰面积为纵坐标，化合物浓度为横坐标，绘制工作曲线，得到本方法的线性范围、回归方程及相关系数，以10 倍信噪比计算90 种那非类化合物的定量限。结果表明，90种化合物在0.1-100 ng/mL 浓度范围内相关系数（r2）均大于 0.99，线性关系良好，定量限为0.01~5 mg/kg。

2.3.2 回收率与精密度

选取红景天保健食品胶囊和软胶囊的空白样品，分别添加1 倍定量限、2 倍定量限和10 倍定量限浓度的混合标准溶液，每个添加水平6 个平行样品，计算化合物的回收率和相对标准偏差(RSD) 。结果表明：平均回收率为61.8 %～119.1 %，RSD 为1.2 %～ 12.9 %。该方法具有较好的回收率和重复性，可满足保健品中90 种那非类非法添加的日常监测要求，结果见表2。

3  结论

本研究基于超高效液相色谱- 四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱，建立了具有提高缺氧耐受力功能的保健品中90 种那非类物质的定性定量方法。该方法快速、准确、灵敏，覆盖那非类药物及其衍生物，可实现一次检测即可分析90 种那非类物质，并能准确定量，适用于具有提高缺氧耐受力功能的保健品中90 种那非类物质的快速筛查测定。

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基金项目：青海省科技计划项目（2017-ZJ-937Q）

第一作者：苏姗姗（1987-），女，博士，工程师，主要从事食品及民族药物检测与研究工作，E-mail：sushanshansss@163.com

1.西宁海关技术中心  西宁  810003  2. 青海省食品安全研究重点实验室  西宁  810003

1. Xining Customs Technical Center, Xining  810003  2. Key Laboratory of Food Safety Research In Qinghai Province, Xining  810003

图1 化合物47 和化合物62 的二级质谱图

Fig.1 MS2 spectra of compound 47 and compound 62

表1 90种那非类物质的保留时间和质谱信息

Table 1 Retention times and mass parameters of 90 nafils

表2 90种那非类物质的平均回收率和相对标准偏差

Table 2 Average recoveries and the relative standard deviations of the 90 nafils

参考文献

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（文章类别：CPST-C）