阮周曦¹ 杨俊兴¹ 黄 韫¹ 蒋光君¹ 花群义¹

摘 要 为评估猪繁殖与呼吸综合征抗体ELISA检测试剂盒的性能差异。采用传染病诊断方法的验证原则，用203份临床样品、PRRS标准阳性血清，比较4种ELISA 试剂盒的分析敏感性、分析特异性、诊断敏感性、诊断特异性、批内重复性等的差异。结果表明4种ELISA试剂盒的精密度良好，kappa值均大于0.90，适用于猪繁殖与呼吸综合征抗体水平监测和免疫效果评估。但不同试剂盒的检测时长有差异，在实际应用中应根据具体情况合理选用。

关键词 繁殖与呼吸综合征；ELISA 试剂盒；评估

 Comparison of 4 Types Indirect ELISA Kits for Detecting Porcine Reproductive  Respiratory Syndrome

 RUAN Zhou-Xi ¹   YANG Jun-Xing ¹   HUANG Yun ¹   JIANG Guang-Jun ¹   HUA Qun-Yi ¹

Abstract To investigate the performance differences of Porcine Reproductive  Respiratory Syndrome (PRRS) antibody ELISA kit.Methods uses 203 clinical samples and PRRS standard positive serum were used to compare the differences in the analytical sensitivity, analytical specificity, diagnostic sensitivity, diagnostic specificity and intra-assay repeatability of 4 ELISA kits.The results showed that the four ELISA kits had good precision and kappa values were all greater than 0.90.However, the detection duration of different kits is different, which should be selected reasonably according to the specific situation in practical application.

Keywords porcine reproductive  respiratory syndrome; ELISA kit; assessment

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive  Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）所引起的一种接触性传染病。临床上主要表现为母猪出现流产、早产、死胎、木乃伊胎、产弱仔胎等，仔猪呈现呼吸困难、咳嗽等呼吸系统障碍^[1]。PRRSV是影响世界范围内养猪业的一种重要动物疾病。 PRRSV具有高度变异性，有美洲型和欧洲型两种毒株，我国流行的均属于美洲型^[2]。2006 年以来，病毒变异引起的高致病性猪蓝耳病发病率、死亡率高，对我国养猪业造成严重危害^[3]。伴随着全球养殖行业的高速发展,交通运输的日趋便利, 客观上为PRRS传播和流行提供了便利条件,也给我国动物疫病防控工作提出了新的挑战。运用先进的科学检测技术，全面普查、及时发现、有效防控是实施PRRS防疫计划的基础。

酶联免疫吸附试验( ELISA)是目前应用最广、发展最快的免疫检测技术，被广泛用于检测PRRSV抗体^[4]，具有灵敏性高、特异性强、重复性好、操作简便等特点。目前，市场上已开发多种检测该病毒的商品化 ELSIA 试剂盒，但缺乏规范科学的评价^[5]。由于PRRSV不同株存在抗原性差异，目前的抗体检测方法不能区分疫苗免疫或野毒感染产生的抗体。但是，通过抗体水平监测猪群中PRRSV 的活跃程度，分析该疾病所处阶段对于全面普查和大规模诊断依然具有非常重要的意义。为了保证检测质量，筛选适用于实验室检测的试剂盒，本研究根据《传染病诊断方法的验证原则》^[6]以及《出入境动物检疫诊断试剂盒质量评价规程》^[7]的要求，采用国产和进口ELISA 试剂盒分别检测3个标准阳性血清和203例猪血清样本中抗体效价，分析比较4种ELISA 试剂盒的分析敏感性、分析特异性、诊断敏感性、诊断特异性、批内重复性等的差异，以便为试剂盒的选用提供参考。

1  材料

1.1 标准阳性血清

猪繁殖与呼吸综合征免疫猪阳性血清（欧洲株，LV疫苗株）、猪繁殖与呼吸综合征免疫猪阳性血清（JXA1-R疫苗株），由中国动物疫病预防控制中心（猪繁殖与呼吸综合征OIE参考实验室）惠赠；猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）鉴别检验用阳性血清（cvcc-z156）购买自中国兽医药品监察所。猪O型口蹄疫阳性血清、猪A型口蹄疫阳性血清、非洲猪瘟阳性血清、猪瘟阳性血清、猪传染性胃肠炎阳性血清由本实验室保存。

1.2 样品来源

样品来源于2019年1月至9月收集来自广东某猪场和湖南某猪场。

1.3 主要试剂

prionics猪繁殖与呼吸综合征抗体检测间接ELISA试剂盒（生产批号：PR160201L）；猪繁殖与呼吸综合征抗体检测间接ELISA试剂盒包括analytikjena品牌试剂盒（生产批号：1016-01），由百沃特（北京）生物技术有限公司提供；IDVET品牌试剂盒（生产批号：993），由深圳市青珊瑚科技有限公司代理；国产康百得品牌试剂盒（生产批号：20161018），由深圳市康百得生物科技有限公司提供。

1.4 主要仪器设备

美国产BIO TEK ELX808酶标仪（仪器编号：200147SD0180）；美国产BIO TEK ELX50洗板机（仪器编号：200847SDB036）；德国MemmertIPP500恒温箱（仪器编号：200947SDB014）等。

2  方法

根据《传染病诊断方法的验证原则》以及《出入境动物检疫诊断试剂盒质量评价规程》（SN/T 2435-2010）的要求，对不同品牌猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体ELISA检测试剂盒7类参数进行评价，包括诊断敏感性(Diagnostic sensitivity，Dse)，诊断特异性(Diagnostic specificity，Dsp)，符合率(Agreement)，分析特异性(Analytical specificity，Asp)，分析敏感性(Analytical Sensitivity，ASe)，再现性(Reproducibility，Rd)，即协同实验和批内重复性(Repeatability，Re)。

2.1 Dse、Dsp和符合率的测定

按照ELISA试剂盒的操作说明书对203份临床样品进行检测（其中，阳性样品126份，阴性样品77份）。按照《传染病诊断方法的验证原则》中规定的方法对检测结果进行统计，分别计算诊断敏感性（Dse）、诊断特异性（Dsp）。用kappa统计学方法，计算不同试剂盒检测结果的kappa值，来评价不同试剂盒检测结果的符合率（kappa值应≥0.600，kappa值越接近于1.000，符合率越高）。计算方法如下：

Dsp=d/(b+d)×100%；Dse=a/(a+c) ×100%;

Po=(a+d)/(a+b+c+d)

Pe=[(a+c)/(a+b+c+d)]*[(a+b)/(a+b+c+d)]+[(b+d)/ (a+b+c+d)]*[(c+d)/(a+b+c+d)]; 

kappa = (Po－Pe)/(1－Pe)

2.2 Asp的测定

猪繁殖与呼吸综合征病毒属于动脉炎病毒属^[8]，同属其他病毒包括马动脉炎病毒（EAV）、乳酸脱氢酶增高症病毒（LDV）以及猴出血热病毒（SHFV）。由于同属病毒只引起特定动物发病，而且有较强的专一性，因此诊断特异性试验选取常见猪病病毒抗体阳性血清，包括口蹄疫病毒抗体阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒阳性血清、猪布鲁氏杆菌病阳性血清，每份样品做3个重复孔。根据检测结果判定试剂盒是否与其他病毒标准阳性血清有交叉反应。

2.3 Ase的测定

将高致病性猪繁殖与呼吸综合征免疫株阳性血清、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征免疫株阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）鉴别检验用阳性血清，进行1:6.25～1:25600系列倍比稀释后，用各品牌试剂盒进行检测。每个血清、每个稀释度进行3个重复孔检测。通过比较不同试剂盒检测抗体的滴度。

2.4 Re的测定

针对四种品牌的试剂盒，同一品牌、批号下各取三个ELISA检测试剂盒，分别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性血清5份和阴性血清3份，共计8份样品，每个试剂盒每个样品做3个重复孔。根据各个试剂盒检测结果的S/P平均值，计算三个试剂盒S/P值的变异系数。

3  结果

3.1 Dse、Dsp和符合率结果

经对203份临床样品进行检测（其中，阳性样品126份，阴性样品77份），严格按照各品牌试剂盒的操作说明书对样品进行检测和读值，并对数据进行了汇总和分析，结果如下：

3.2 Asp的测定结果

经对口蹄疫病毒抗体阳性血清、猪瘟病毒抗体阳性血清、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清、猪传染性胃肠炎病毒阳性血清、猪布鲁氏病杆菌阳性血清进行检测，结果均为阴性，无交叉反应。

3.3 Ase的测定结果

经检测1:6.25～1:25600系列倍比稀释后的高致病性猪繁殖与呼吸综合征免疫株阳性血清、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征免疫株阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（JXA1-R株）鉴别检验用阳性血清。各品牌检测试剂盒结果如下：

3.4 Re的测定结果

用同一批号的三个ELISA检测试剂盒，分别检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体阳性血清5份和阴性血清3份，共计8份样品，每个试剂盒每个样品做3个重复孔。根据各个试剂盒检测结果的S/P平均值，计算三个试剂盒S/P值的变异系数。

3.5 各品牌试剂盒检测流程比较

根据各品牌试剂盒的操作说明，对各品牌试剂盒检测原理和检测流程，所需检测时间、孵育温度等条件进行横向比较，见表5。

4  讨论

(1) 近年来，PRRS在我国不同地区均有一定的流行趋势，且猪场一旦感染该病就很难净化，控制该病最重要的是及时进行流行病学监测并采取相应的防疫策略。鉴于可检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体的商品化ELISA试剂盒品种较多，因此对此类产品按照《传染病诊断方法的验证原则》进行评估，确保检测结果能够客观、真实地反映检测样品的情况，进而体现猪场的免疫水平，为防疫策略的制定和调整提供数据支撑就显得尤为重要^[9]。

(2)商品化ELISA检测试剂盒基于操作简单，对环境设施、配套设备要求低的特点，非常适用于在基层实验室、养殖场对已免疫动物的抗体消长情况监测工作；也是各级各类动物检疫/兽医实验室开展动物疫病抗原/抗体监测，客观分析和评价动物疫病流行和变化趋势，正确评估疫苗保护时间和免疫程序，进而为做好免疫、净化和消灭相关动物疫病的实验室主要的检测方法。但目前市场上商品化ELISA检测试剂盒质量良莠不齐，还存在因地区差异国外检测试剂盒所选用单抗株不一定特异性适用国内流行株/免疫株的情况，因此，选择特异性强、灵敏度高、可重复性好的商品化ELISA检测试剂盒就显得尤为重要。同时，ELISA检测方法多为群体评估，样品量大，操作简便、经济实惠也是实验室的考量因素之一。

(3) 此次对4种商品化试剂盒进行诊断敏感性(Diagnostic sensitivity，Dse)，诊断特异性(Diagnostic specificity，Dsp)，分析特异性(Analytical specificity，Asp)，分析敏感性(Analytical Sensitivity，ASe)和批内重复性(Repeatability，Re)的综合评估，kappa值均大于0.90，均体现了良好分析特异性（Asp）和分析敏感性（ASe），批内重复性 (Re)CV值变化不大，适用于猪场的猪繁殖与呼吸综合征抗体水平监测和免疫效果评估。

(4)结合各品牌试剂盒检测原理和检测流程，所需检测时间、孵育温度等条件进行横向比较，IDVET和康百得品牌试剂盒操作时间较短，但康百得品牌试剂盒对样品稀释比例较高，稀释样品时需谨慎操作；Prionics和Analytikjena品牌试剂盒虽耗时长一倍，但符合率均达到98%及以上。据此，在实际使用过程中应根据具体实验目的合理地进行选用。

【该文经CNKI学术不端文献检测系统检测，总文字复制比为2.9%。】

基金项目：国家重点研发计划课题（2016YFD0500708）

作者简介：阮周曦（1981-），男，高级兽医师，主要从事动物检疫技术研究，E-mail:14530787@qq.com

1.深圳海关  深圳  518045 

1. Shenzhen Customs，Shenzhen  518045

表1 试剂盒评价结果数据

Table 1 Results of ELISA Kit

表2 试剂盒评价指标值

Table 2 Value of Evaluation Index in each kit

图1 各试剂盒评价结果对比图

Fig.1 Value of evaluation index

表3 各品牌试剂盒检测结果判定为阳性的标准阳性血清最高稀释倍数

Table 3 The test results of each kit were determined to be the highest dilution ratio of the standard positive serum

表4 各品牌试剂盒批内重复性试验变异系数汇总

Table 4 Variation Coefficient of Repeatable test in each kit

表5 各品牌试剂盒检测原理和流程对比

Table 5 Comparison of Testing Principle and Process of each kit

参考文献

［1］马思续,崔春晓,张留君,等.不同包被抗原检测PRRS抗体间接ELISA方法的建立[J].中国兽医学报, 2018, 38(06):1082-1087.

［2］李志杰,提金凤,李舫,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J].动物医学进展, 2016, 37(11):36-42.

［3］国家高致病性猪蓝耳病防治指导意见(2017-2020) [Z].

http://www.moa.gov.cn/nybgb/2017/dsiqi/201712/t20171230_6133457.htm.

［4］官家明,施开创,陈汉忠,等.猪繁殖与呼吸综合征病毒检测技术研究进展[J].动物医学进展, 2013, 34(8):88-92.

［5］李乃果,贾松涛.不同进口蓝耳病病原抗体ELISA检测试剂盒比较及应用浅析[J]. 中国猪业, 2019, 5:82-84.

［6］Principles and methods of validation of diagnostic assays for infectious diseases (NB: Version adopted in May 2013) .http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/1.01.06_VALIDATION.pdf.

［7］SN/T 2435-2010.出入境动物检疫诊断试剂盒质量评价规程[S] .

［8］周磊,杨汉春.猪繁殖与呼吸综合征综合防控技术与应用[J]. 中国畜牧杂志, 2015, 52(6):62-67.

［9］何海健,刑刚,马涛.3种猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒的比较与应用[J]. 中国畜牧兽医, 2014, 41(6):211-215.

 （文章类别：CPST-C）