阿尔蔼·塔拉哈提¹ 黄 凯¹ 蒋晓玲¹ 姚 武^1*

摘 要 PCR技术即聚合酶链式反应，是一种体外酶促合成特定基因或DNA片段的分子生物学技术，因其灵敏、快速、简便、特异性强等优点，现已广泛应用于多种疫源性疾病的诊断、疫情研判及感染溯源等领域。本文叙述了C-PCR、荧光定量RT-PCR、微滴式数字PCR等技术在甲型流感病毒、中东呼吸综合征冠状病毒及新型冠状病毒中的检测运用，为口岸传染病检测提供思路。PCR技术虽应用广泛，但其发展和运用受多种因素的影响有出现假阴性和假阳性结果的可能，利用实验室的质量控制手段来保证检测结果能从根本上减少误差产生的概率，从而为传染病的准确检出提供有力的保证。

关键词 PCR技术；口岸传染病检测；甲型流感病毒；中东呼吸综合征；新型冠状病毒

 Application of PCR Technology in Detection of Infectious Diseases at Ports

A Er Ei·TA La Ha Ti¹  HUANG Kai¹  JIANG Xiao-Ling¹  YAO Wu^1*

Abstract PCR technology, or polymerase chain reaction, is a molecular biology technology for enzymatically synthesizing specific genes or DNA fragments in vitro. Because of its sensitivity, rapidity, simplicity, and strong specificity, it has been widely used in the diagnosis of sexual diseases, epidemic research and judgment, and infection tracing in many epidemic sources. This paper reviews the application of C-PCR, fluorescence quantitative RT-PCR, microdrop digital PCR and other technologies in the detection of influenza A virus, Middle East respiratory syndrome coronavirus and new coronavirus, and provides ideas for the detection of infectious diseases at ports. Although PCR technology is widely used, its development and application are affected by many factors, and false negative and false positive results may occur. The quality control methods of the laboratory are used to ensure that the test results can fundamentally reduce the probability of error, so as to provide a strong assurance for the accurate detection of infectious diseases.

Keywords PCR technology; detection of infectious diseases at ports; Influenza A virus; Middle East Respiratory Syndrome(MERS); novel coronavirus

近年来，国际经济贸易的迅速发展和经济全球化趋势的加速正持续影响和改变着人们的生活习惯、思维模式和行为方式，造成国际传染病疫情频发，且波及范围广、影响程度大。如2003年的SARS、2009年的甲型H1N1流感、2012年的中东呼吸综合征、2014年的埃博拉出血热、2015～2016年的寨卡病毒病、2016年的黄热病、2017年的马达加斯加鼠疫，再到2019年的新型冠状病毒肺炎等，各种严重传染病疫情的暴发和跨境传播已成为威胁国家和地区安全的关键性问题。

随着口岸输入输出的风险在不断提高，各口岸针对传染病的防控责任也日益加大。出入境人员传染病的检测工作，是切实做好传染病防控和突发公共卫生事件应对工作的重要环节，快速的通关环境和严格的卫生检疫要求口岸现场对疑似病例进行快速诊断，PCR技术作为一种特异性高、灵敏度高、诊断迅速的技术手段，在口岸传染病检测方面得到广泛运用，对有效做好出入境人员传染病检测、保障出入境人员健康、防止传染病输入及输出具有重大意义。

1  PCR技术的形成与发展

目前国内外报道了许多应用于传染病的检测技术，检测技术包括传统微生物分离培养、血清免疫学检测、分子生物学检测、基因芯片技术、PCR技术等，其中PCR技术是传染病检测工作的重要手段。PCR技术又称核酸体外扩增技术和体外基因扩增技术，是当今分子生物学中应用最为广泛的一项技术，它主要包括荧光定量RT-PCR技术、反向PCR技术、锚定PCR技术、热对流PCR技术、不对称PCR技术、反转录PCR技术、修饰引物PCR技术、巢式PCR技术和微滴式数字PCR技术等。

它的反应原理是对体内DNA的复制过程进行模拟，是一种将靶序列两端互补的寡核苷酸引物在体外扩增DNA分子的分子生物学技术。利用模板DNA或经PCR扩增形成的双链DNA在体外90~95℃高温时由双链解离成为单链，接着冷却至55~60℃，引物与模板DNA单链按照碱基互补配对的原则结合，再调温度至70~75℃，即DNA聚合酶最适反应温度，在DNA聚合酶的作用下，DNA模板-引物结合物将以dNTP为反应原料，靶序列为模板，通过半保留复制原理和碱基互补配对原则，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。这种新链又将成为下次半保留复制链重复循环的模板。基于聚合酶制造的PCR仪实际上就是一个温控设备，能够在变性温度、复性温度以及延伸温度之间进行很好的控制。

2  PCR技术在口岸传染病检测中的应用

在近20年的时间里，PCR及其相关技术的发展速度惊人，并广泛用于传染病的检测诊断、肿瘤癌基因的诊断研究和基因工程等很多领域。口岸传染病的发生常涉及到外源基因的侵入，如细菌、病毒等感染机体，把它们的基因带入被感染的机体。PCR技术具有快速、特异、敏感和易于操作的特点，消除了细菌培养、血清学、免疫学方法测定抗原抗体等检测方法中灵敏度和特异性不够等问题，正是由于这些优点，PCR技术在口岸传染病的检测得到了广泛应用。

2.1 C-PCR用于甲型流感病毒检测

先设计出适用于C-PCR检测的引物和探针，以鼻咽拭子样本中提取的 RNA 为模板，其反应体系详见表1。

表1  甲型流感病毒检测C-PCR反应体系

Table 1  C-PCR reaction system for Influenza A virus detection

将模板变性温度设为96℃，复性温度设为50℃，反应时间为25 min。结果判断：其中检测试纸条的T点为检测线、C点为对照线，以检测试纸条的C点和T点是否出现条带作为判断甲型流感病毒核酸是否为阳性的依据。

有研究证明，用入境发热人员的鼻咽拭子和甲、乙型流感病毒毒株的样本验证C-PCR的检测灵敏度、特异性及稳定性来看，C-PCR检测技术对阳性样本的检出率为百分之百，对阴性样本检测的错检率也维持在很低的水平，仅为2.56%（在口岸流感筛查中，一定比例的错检可通过后期的实验室确认工作中得到纠正），且未发现甲型和乙型流感病毒交叉错检的情况。因此，C-PCR检测系统因其检测速度快、操作简单、对环境要求低等优点，可以为口岸传染病检测提供一种新的思路。^[1]

2.2 荧光定量RT-PCR用于中东呼吸综合征冠状病毒检测

首先根据相关文献资料设计出基于upE、ORF1b、N2三个靶标建立单重、双重或三重MERS-CoV的核酸检测方案，然后选取TaKaRa一步法荧光定量PCR试剂盒，其反应体系详见表2。

表2  中东呼吸综合征冠状病毒RT-PCR反应体系

Table 2  Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus RT-PCR Reaction System

分别加入核酸模板和阴性对照5uL。反应程序为：42℃、5 min，5℃、10s，95℃、10 s，60℃、45 s，开启40个循环，在60℃检测荧光。最后根据有无扩增曲线及样本的Ct值进行结果判定。

有研究和实验结果表明，基于MERS-C-oV三个靶标的单重、双重或三重荧光定量RT-PCR检测方案，均能达到最低检测限为10 PFU/mL，与其他常见呼吸道病毒的阳性样本均无交叉反应，且不同检测批次具有较好的重复性。因此，该检测技术方案具有较高灵敏度与特异性及适用性用于MERS-CoV感染的实验室诊断。 ^[2]

2.3 PCR用于新型冠状病毒（2019-nCoV）检测

2.3.1 实时荧光RT-PCR检测 

采用新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）对 ORF1ab 基因和核壳蛋白 N基因进行 PCR 扩增，其反应体系见表3。

表3  新型冠状病毒 2019-nCoV 核酸检测R反应体系

Table 3  Novel coronavirus 2019-nCoV nucleic acid detection R reaction system

分别加入模板核酸、阴性对照、阳性对照5 uL。反应程序如下：50℃、15 min，95℃、15 min，94℃、15 s，55℃、45 s，开启45 个循环，在55℃检测荧光。结果判读如下：

(1)如果无明显S型扩增曲线，判定检测结果为阴性；

(2)如果一份标本中有S型扩增且Ct值≤38，根据检测标本所对应的荧光通道按表4进行判定；

(3)如果有S型扩增，且38＜Ct值≤40，视其为不确定样品，需重新检测，若复检后仍有S型扩增，且Ct值范围不变，根据检测目标所对应的荧光通道按表4进行判定，否则判定检测结果为阴性。

值得一提的是，基于实时荧光RT-PCR的新型冠状病毒的不同标本类型核酸检测结果显示，粪便标本阳性检出率最高，鼻咽拭子和痰液标本阳性检出率相对粪便标本较低，口咽拭子阳性检出率最低。^[3]因此，多次、多样本类型综合检测更能提高检出率，从而检出更多的确诊病例及无症状感染者，确保切断传播途径。^[4]

表4  实时荧光RT-PCR检测结果判定与分析

Table 4  Judgment and analysis of real-time fluorescent RT-PCR detection results

2.3.2 微滴式数字PCR(ddPCR)检测 

第三代PCR及数字PCR的产生，是采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，来确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。微滴式数字PCR(ddPCR)检测是在传统的PCR扩增前对样品微滴化处理，将含有核酸分子的PCR反应体系分散成为成千上万个纳升级的微滴（每个微滴不含或含有一个至数个待检核酸靶分子），当PCR扩增后逐个对微滴进行检测，并根据泊松分布原理和有荧光信号的阳性微滴的个数及比例得出靶的分子的起始拷贝数或浓度进行判定。

微滴式数字PCR(ddPCR)检测技术因其不依赖于阳性标准参照、检出效率不受PCR抑制剂的影响、有较高的灵敏度和精确性、适合低载量病毒等优点，对疑似人群的早期筛查、弱阳性样本的复测，以及环境中微量病毒表达的检测有一定作用，有助于优化制定适当的诊断策略，以便及时、快速地控制新型冠状病毒的感染。^[4]

3  结语

我国国境口岸重大传染病疫情防控是国家传染病防控不可或缺的一个环节，通过内防输入和外防输出遏制疫情通过口岸传播扩散是海关卫生检疫部门的责任，其中，传染病检测实验室是保障口岸传染病检出的不可或缺的后备检测力量。PCR技术的建立为传染病检测提供了快速、灵敏及特异的实验室筛查与确诊手段，可以及时为传染病确诊提供检测依据，能够进一步提高口岸传染病检测的应对与防控能力。

PCR这种基因扩增技术因其简单易行，应用已极为广泛，但其发展和运用受很多因素的影响，PCR技术假阴性的产生原因是复杂多样的，例如PCR仪设计原理上的差异和经常出现的温控不准等质量问题，离心机的质量或使用不正确造成离心标本模板没有被完整分离，在临床标本核酸提取过程中靶核酸的丢失和提取试剂的残留，扩增仪孔间温度差异，标本中抑制物的去除不彻底，以及标本或核酸纯化过程中出现的扩增反应抑制物等问题都会造成假阴性结果的产生。^[5]

同时由于PCR技术对所检测的核酸模板进行大量扩增，在得到极大检测灵敏度的同时，对检测中的错误也有极大的放大作用，还可能因实验室污染而出现假阳性结果。因此，必须慎重报告PCR的检测结果，要有相应严格的质量控制措施。目前PCR技术最容易产生检测误差的环节, 在于标本采集的准确性、核酸样本的纯化、试剂改进、人员操作等方面。把控好核酸提取试剂的标准化，以及传染病实验室检测程序的规范化能从根本上减少误差产生的概率，从而为传染病的准确检出提供有力的保证。

【该文经CNKI学术不端文献检测系统检测，总文字复制比为6%。】

第一作者：阿尔蔼·塔拉哈提（1991-），女，哈萨克族，新疆阿勒泰人，大学本科，主要从事口岸卫生检疫工作，E-mail：275372019@qq.com

通讯作者：姚武（1968-），男，汉族，新疆乌鲁木齐人，大学本科，主要从事进出口货物监督管理工作，E-mail：yaowujimunaihg@163.com

1.吉木乃海关  吉木乃  836800

1. Jimnai customs District, Jimnai  836800  

参考文献

[1]杨坤宇,陈帆,张师音.等. 热对流PCR用于甲型流感病毒检测的评价[J].中国国境卫生检疫杂志, 2017, 40(3): 156-163.

[2]牛培华,陆柔剑,蓝佳明.等.中东呼吸综合征冠状病毒多重荧光定量RT-PCR检测技术的建立[J].病毒学报, 2016, 32(3): 349-354.

[3]周刚,李超,郑国栋.等.基于实时荧光 RT-PCR 的新型冠状病毒的不同标本类型核酸检测[J].分子诊断与治疗杂志, 2020, 12(4): 406-418.

[4]郭兆,王芳,郭妍譞.等.微滴式数字PCR技术在新型冠状病毒检测中的潜在价值[J].兰州大学学报(医学版), 2020, 46(2): 14-18.

[5]李金明.聚合酶链反应临床应用的优越性和局限性[J].中华检验医学杂志, 2005, 28(3): 406-409.

（文章类别：CPST-A）