王恩花¹ 齐 玮² 万晓楠² 艾 强¹ 魏怡冰¹ 宋善敏¹ 雷 阳^1*

摘 要 兴义矮脚鸡是兴义市独具特色的地方优良鸡种，肉质鲜美。本文以兴义矮脚鸡为研究对象，采用高效液相色谱法测定其肌苷酸含量。结果表明：兴义矮脚公鸡胸肌、腿肌中肌苷酸含量分别为2.1645 g/kg、1.5570 g/kg，母鸡胸肌、腿肌中肌苷酸含量分别为2.1391 g/kg、1.1550 g/kg，矮脚鸡胸肌的肌苷酸含量略高于腿肌的肌苷酸含量。为兴义矮脚鸡的开发利用提供科学依据。

关键词 HPLC；兴义矮脚鸡；含量测定；肌苷酸

 Determination of Inosinic Acid in Xingyi Bantam by HPLC

WANG En-Hua¹  QI Wei²  WAN Xiao-Nan²  AI Qiang¹

WEI Yi-Bing¹  SONG Shan-Min¹  LEI Yang^1*

Abstract Xingyi bantam, as a fine local strain of chickens, is known for its delicacy. In this study, high performance liquid chromatography (HPLC) was applied to analyze the content of inosinic acid in Xingyi bantam. The results showed that the inosinic acid content of breast muscle and leg muscle of the rooster was 2.1645 g/kg and 1.5570 g/kg, respectively. The corresponding contents of the hen was 2.1391 g/kg and 1.1550 g/kg, respectively. The content of inosinic acid in breast muscle of Xingyi bantam was slightly higher than that in leg muscle. This study provides a scientific basis for the development and utilization of Xingyi bantam.

Keywords HPLC; Xingyi bantam; determination of content; inosinic acid

随着经济的发展和人民生活水平的提高，人们对肉制品的品质及风味的要求越来越高，因此，肉质鲜嫩、风味独特的家禽肉制品逐渐受到人们的青睐^[1]。氨基酸和核苷酸是对肉类及其肉制品的鲜味贡献最大的两类物质，其中肌苷酸（inosine-5'-monophosphate,IMP）鲜味最强，已经成为衡量肉质品质的一项重要指标^[2-3]。其原因在于谷氨酸钠与IMP之间有较强的正相协同作用，使谷氨酸钠的鲜味指标成倍地增加^[4]。兴义矮脚鸡因身矮脚短而得名，是贵州省兴义市独具特色的地方优良品种之一，其肉质鲜美，深受群众喜爱，被列入《贵州畜禽品种志》^[5]。

鸡肉中的风味物质由香味物质和滋味物质组成。滋味物质包括游离氨基酸、肌苷酸及相关核酸代谢产物、还原糖、小肽等^[5]。香味物质的风味成分占据相当大的比例，对鸡肉的整体风味起着重要的作用，被报道的已有几百种，主要包括各种酯类、醛类、酸类、醇类、酮类、呋喃类、吡嗪类、氨化物及含硫化合物等^[6-8]。有多位学者采用不同方法对不同鸡种的肌苷酸进行测定^[9-15]，如：张小玲^[10]等人选取8个优质鸡新品系70日龄和92日龄鸡98只，将胸肌肌内脂肪(IMF)和肌苷酸(IMP)含量进行了比较，结果显示：不同品系、性别和日龄鸡肌内脂肪和肌苷酸含量均有较大差异；宋焕禄^[12]等人研究测定不同鸡种肌苷酸含量，结果表明：一年生固始母鸡的IMP含量是A-A鸡的2倍多，130日龄固始母鸡的IMP含量约是A-A鸡的2倍，90日龄固始鸡公鸡的IMP含量比A-A鸡多50%；中华宫廷黄鸡肌肉中的IMP含量比A-A鸡高;陈国宏^[13]等人的研究表明：不同品种、日龄、部位、性别的IMP和IMF的含量相差很大。而兴义矮脚鸡肌苷酸的含量测定尚未见报道。目前测定畜禽肌苷酸含量有以下方法：TLC、UV、和HPLC等，其中HPLC法简单快捷、重现性好、灵敏度高。本研究运用HPLC法测定兴义矮脚鸡鸡肉肌苷酸含量，该方法简便、测定准确，为兴义矮脚鸡的开发利用提供科学依据。

1  材料与方法

1.1 样品采集

试样用矮脚鸡样品6只（公母各半）来自贵州省兴义市,采集胸肌和腿肌鸡肉样品，冷冻保存备用。

1.2 主要仪器和试剂

岛津LC-16型高效液相色谱仪、离心机、超纯水仪、色谱柱：Topsil C18 Colum 4.6 mmtimes;250 mm，5 mu;m，Lot Number：T2101.10、超声波清洗器、甲醇（HPLC级）、磷酸二氢钾（HPLC级）、KOH（HPLC级）。

1.3 试剂的制备

1.3.1 纯水

由纯水系统制得的超纯水。

1.3.2 流动相的制备

0.05 mol/L磷酸二氢钾（调pH为6.5），0.5 mol/LKOH、5 mol/LKOH、甲醇（HPLC级）。

1.3.3 肌苷酸标准品

肌苷酸标准品（购买于国家标准物质网，含量ge;99%），储备液配制：称取肌苷酸标准品0.0204 g，用适量纯化水溶解后定量转移至100 mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，摇匀，得浓度为204.0000 mu;g/mL的储备液，工作溶液：将储备液稀释为5.1000 mu;g/mL、10.2000 mu;g/mL、20.4000 mu;g/mL、40.8000 mu;g/mL、81.6000 mu;g/mL、102.0000 mu;g/mL系列浓度梯度标准工作溶液，将储备液及工作溶液置于4℃冰箱保存备用。

1.4 样品处理

将样品从冰箱中取出解冻24 h后，取样品在组织捣碎机中捣碎均匀后，准确称取样品1.0000 g，放在10 mL离心管中，加入4 mL6%的HClO₄，匀浆5 min后，取2 mL6%HClO₄洗涤匀浆器，收集匀浆液以3000 r/min的速度离心5 min，收集上层清液置于10 mL离心管中。于沉淀中再加2 mL6%HClO₄旋涡震荡5 min后，离心5 min，合并两次滤液，用0.5 mol/LKOH、5 mol/LKOH调节pH至6.5，然后转移至25 mL容量瓶中定容摇匀，样品溶液经0.45 mu;m滤膜过滤后上机测定。

1.5 色谱条件

色谱柱：Topsil C18 Colum 4.6 mmtimes;250 mm，5mu;m，Lot Number：T2101.10，紫外检测器检测波长254 nm，进样量10 mu;L，流速为1 mL/min，0.05 mol/L磷酸二氢钾（调pH为6.5）：甲醇=85:15，检测时间：6 min，柱温：35℃。

2  结果与分析

2.1 肌苷酸HPLC色谱图

标准品溶液和样品溶液色谱图，见图1、2、3。

图1  标准品图谱（5.1000 mu;g/mL）

Fig.1  Standard Atlas（5.1000 mu;g/mL）

图2  样品溶液（腿肌）图谱

Fig.2  Atlas of sample solution (leg muscle)

图3  样品溶液（胸肌）图谱

Fig.3  Atlas of sample solution (pectoral muscle)

2.2 线性关系及线性范围

分别准确移取浓度为200.4000 mu;g/mL肌苷酸标准品储备液适量，配制成浓度分别为5.1000 mu;g/mL、10.2000 mu;g/mL、20.4000 mu;g/mL、40.8000 mu;g/mL、81.6000 mu;g/mL、100.200 mu;g/mL的系列梯度浓度的标准工作溶液，分别精密吸取上述系列浓度梯度标准工作溶液，按1.5色谱条件测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，外标法定量。结果为：线性回归方程为y=12384.4x+12090.3，R2 = 0.9999，肌苷酸浓度在5.1000 mu;g/mL~100.2000 mu;g/mL范围内线性关系较好。

2.3 精密度试验

准确吸取浓度为5.1000 mu;g/mL的肌苷酸标准工作溶液，重复进样6次，结果为：肌苷酸峰面积平均值为73496 mAU，RSD为1.08%，见表1。

表1  精密度试验结果

Table 1  The results of precision test

	保留时间/min	峰面积/mAU	浓度/mu;g/mL
1	3.688	73871	4.9886
2	3.684	73930	4.9934
3	3.691	74001	4.9991
4	3.689	72993	4.9177
5	3.681	74085	5.0059
6	3.685	72096	4.8453
平均值	3.686	73496	4.9583
RSD/%	0.10	1.08	1.29

2.4 重复性试验

准确吸取浓度为10.2000 mu;g/mL的肌苷酸标准工作溶液，重复进样6次，对肌苷酸的含量重现性及保留时间进行分析，其平均含量为10.1270 mu;g/mL，RSD为1.26%，结果见表2。

2.5 回收率试验

按方法1.4处理制备样品提取液，然后取浓度为：59.5906 mu;g/mL的样品溶液5 mL于10 mL试管中，再加入5 mL 浓度为41.4274 mu;g/mL的肌苷酸标准工作溶液定容至10 mL，摇匀，对加标前后溶液进行肌苷酸含量进行分析，根据加标前后溶液肌苷酸浓度变化占加标量的百分比计算肌苷酸的回收率，平行测定6次，结果测得平均回收率为100.17%，RSD为3.59%，见表3。

2.6 矮脚鸡肉肌苷酸含量测定

按仪器方法测定矮脚公鸡胸肌、腿肌中肌苷酸含量结果分别为：2.1645 g/kg、1.5570 g/kg，RSD分别为：2.42%、3.30%。矮脚母鸡胸肌、腿肌中肌苷酸含量结果分别为：2.1391 g/kg、1.1550 g/kg，RSD分别为：4.08%、3.83%。结果见表4。

表2  重复性试验结果

Table 2  The results of Repeatability test

	保留时间/min	面积/mAU	浓度/mu;g/mL
1	3.695	138457	10.2037
2	3.698	135469	9.9624
3	3.688	136502	10.0458
4	3.670	136489	10.0448
5	3.674	137581	10.1330
6	3.691	138541	10.2105
平均值	3.686	137506.5	10.1270
RSD/%	0.31	1.15	1.26

表3  加样回收试验结果

Table 3  The results of sample recovery test

	1	2	3	4	5
加标量/mu;g	207.1370	207.1370	207.1370	207.1370	207.1370
加样量/mu;g	297.9530	297.9530	297.9530	297.9530	297.9530
实测浓度	50.0523	51.0136	51.6314	50.0336	49.9865
实测量/mu;g	500.5230	510.1360	516.6314	500.3360	499.8650
回收率/%	97.80	102.44	105.42	97.70	97.48
平均值/%			100.17
RSD/%			3.59

表4  矮脚鸡肉IMP含量测定结果

Table 4  The results of IMP content determination of Bantam Chicken

公/母	胸/腿肌	平行	IMP含量/g/kg	平均值	RSD/%
公	胸肌	1	2.1805	2.1645	2.42
		2	2.1061
		3	2.2069
	腿肌	1	1.5564	1.5570	3.30
		2	1.6084
		3	1.5056
母	胸肌	1	2.1030	2.1391	4.08
		2	2.1752
		3	2.0014
	腿肌	1	1.2056	1.1550	3.83
		2	1.1235
		3	1.1359

3  讨论

肌苷酸作为鲜味物质，是影响鸡肉鲜味和风味的重要指标之一，因5'-IMP与谷氨酸钠之间较强正相相关性，当肌苷酸与谷氨酸钠的比例为1∶5-1∶20时，谷氨酸钠的鲜味指标可提高6倍，其机理可能是螯合作用的原因^[16]。本研究首次运用HPLC法测定兴义矮脚鸡肌肉中肌苷酸含量，采用色谱柱：Topsil C18 Colum 4.6 mmtimes;250 mm，5 mu;m，Lot Number：T2101.10，紫外检测器检测波长254 nm，进样量10 mu;L，流速为1 mL/min，0.05 mol/L磷酸二氢钾（调pH为6.5）：甲醇=85:15，检测时间：6 min，柱温：35℃。

本实验结果表明，HPLC法测定兴义矮脚鸡肌肉中肌苷酸含量，6 min内肌苷酸可以很好地分离，图谱清晰。本研究分别测定了兴义矮脚鸡胸肌和腿肌肌苷酸含量结果表明，矮脚公鸡鸡胸、腿肌中肌苷酸含量分别为2.1645 g/kg、1.5570 g/kg，矮脚母鸡鸡胸、腿肌中肌苷酸含量分别为2.1391 g/kg、1.1550 g/kg，矮脚鸡胸肌的肌苷酸含量略高于腿肌的肌苷酸含量。

4  结论

HPLC法测定兴义矮脚鸡肌肉中肌苷酸含量，该方法简单可靠，图谱清晰，6 min以内能够较好地分离肌苷酸，可用于兴义矮脚鸡鸡肉中肌苷酸含量测定。兴义矮脚公鸡胸肌中肌苷酸含量与母鸡无明显差异，公鸡腿肌肌苷酸含量高于母鸡腿肌肌苷酸含量，矮脚鸡胸肌的肌苷酸含量略高于腿肌的肌苷酸含量，为兴义矮脚鸡的开发利用提供科学依据。

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第一作者：王恩花（1990-），女，布依族，贵州安龙人，硕士研究生，助教，主要从事食品、药品检测与研究工作，E-mail：853304573@qq.com

通讯作者：雷阳（1969-），女，汉族，贵州贵阳人，硕士研究生，正高级讲师，研究方向为农特产品质量安全，E-mail：515538011@qq.com

1. 贵州农业职业学院  贵阳  551400

2.北京海关技术中心  北京  100000

1. Guizhou Vacational college of Agriculture, Guiyang  551400

2. Beijing Customs Technical Center, Beijing  100000

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（文章类别：CPST-A）