林伟坚¹ 谢志榕¹ 唐辉灿¹ 康海宁¹ 沈金灿¹ 李雅玫¹

摘 要 本文建立了一种测定鱼肉中3种微囊藻毒素的方法。样品用甲醇溶液提取后，经C18固相萃取柱净化后，采用高效液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。在0.2~5.0 μg /L浓度范围内，微囊藻毒素RR、微囊藻毒素YR和微囊藻毒素LR有良好的线性关系，线性相关系数均大于等于0.999，定量限均在0.2 μg/kg以内。考察了空白鱼类样品添加3个浓度水平的回收率结果，样品中微囊藻毒素RR、YR和LR的回收率分别为95.0%~96.5%、93.0%~102%和88%~101%，RSD在4.41%以内。

关键词 微囊藻毒素；鱼肉；高效液相色谱-串联质谱

 Determination of Three Microcystins in Fish by High Performance Liquid Chromatography Tandem- Mass Spectrometry

LIN Wei-Jian¹  XIE  Zhi-Rong¹  TANG Hui-Can¹

KANG Hai-Ning¹  SHEN Jin-Can¹  LI Ya-Mei¹

Abstract A method for the determination of three microcystins in fish was developed in this paper. The samples were extracted with methanol and purified by C18 SPE column, with high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry for determination and external standard method for quantification. The method showed good linearities when the concentration of microcystin RR, microcystin YR and microcystin LR ranged from 0.2~5.0μg/L, the correlation coefficients were either greater than or equal to 0.999, and the limits of quantitation were all within 0.2μg/kg.. Three different concentration levels of microcystin RR, YR and LR were added in fish samples, the recovery rates of microcystin RR, YR and LR were between 95.0%~96.5%, 93.0%~102% and 88%~101% respectively, and the RSDs were within 4.41%.

Keywords microcystins; fish; HPLC-MS/MS

微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是由铜绿微囊藻 ( Microcystem aeruginosa) 、鱼腥藻( Anabaena sp) 和颤藻( Oscillatoria sp) 等淡水蓝藻产生的一类单环七肽类肝毒素，是富营养化淡水水体中最常见的藻类毒素之一，具有毒性大、分布广和结构稳定等特点^[1]。由于它能抑制蛋白质磷酸酯酶，从而帮助解除对细胞增殖的正常制动作用，促进肿瘤的发育，是肝癌的强烈促癌剂。MCs 结构通式见图1，其环肽结构中含有X和Y两个可变氨基酸基团，X和Y的不同氨基酸组合可以形成相应的MCs异构体，Adda链是MCs生物活性表达必需的结构。现已发现的MCs达90多种，其中 MC-LR、MC-RR 和MC-YR 等(L、R、Y分别代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸) 是目前研究较多的种类^[2-3]。

图1  微囊藻毒素的化学结构

Fig.1  Chemical structure of microcystin

目前，对于微囊藻毒素的测定方法有酶联免疫分析法^[3-4]、液相色谱法^[5]、液相色谱-质谱法^[6]以及气相色谱-质谱法等^[7]，液相色谱法具有重现性好，选择性高等优点，是微囊藻毒素检测应用较多的方法之一。由于样品基质比较复杂，且有大量干扰物质存在，容易产生假阳性。相对于液相色谱法，液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）可以通过以质谱图、分子离子峰的准确质量、碎片离子峰强比、同位素离子峰等为依据，对待测毒素进行定性、定量，能够减少假阳性误判；并且其灵敏度更高，可提供更为可靠的结果，因而在毒素检测中得到广泛应用^[8-9]。本文采用高效液相色谱-串联质谱仪，建立了快速准确测定鱼肉中微囊藻毒素RR、微囊藻毒素YR和微囊藻毒素LR的方法。

1  实验部分

1.1 仪器与试剂

本实验使用岛津超高效液相色谱仪LC-30A与三重四级杆质谱仪LCMS-8050联用系统,具体配置为LC-30AD×2输液泵，DGU-20A 5R在线脱气机，SIL-30AC自动进样器，CTO-30A柱温箱，CBM-20A系统控制器，LCMS-8050三重四级杆质谱仪，LabSolutions Ver 5.82色谱工作站。涡旋振荡器（德国Heidolph公司），离心机（德国Sigma公司，型号3-18K），氮吹仪（美国TurboVap LV）。

乙腈、甲醇、甲酸为色谱纯试剂( 德国Merck公司)，C18固相萃取小柱(6 mL，500 mg，美国Agilent公司) ，微孔滤膜( 0.22 μm，有机系) ，微囊藻毒素RR、微囊藻毒素LR、微囊藻毒素YR标准品(购自德国Dr．Ehrenstorfer 公司) 。微囊藻毒素标准溶液: 称取适量标准品，用甲醇配制成100 μg/mL标准储备液，-20℃避光保存。

1.2 分析条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱：Shim-pack XR-ODS III（1.6 μm，2.0 mm×50 mm）；流动相：A为0.1%甲酸的甲酸铵溶液（5 mmol/L），B为95%乙腈水溶液（含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵）；采用梯度洗脱条件，梯度洗脱条件见表1；流速：0.3 mL/min，进样体积：20μL，柱温：40℃。

表1  梯度洗脱程序

Table 1  Gradient elution program

1.2.2 质谱条件 

离子源：ESI,正离子模式；雾化气：氮气3.0 L/min；干燥气：氮气10 L/min；碰撞气：氩气；脱溶剂管温度：250℃；加热模块温度：400℃；扫描模式：多反应监测（MRM）；驻留时间：100 ms；延迟时间：3.0 ms；MRM质谱参数详见表2。

表2  微囊藻毒素质谱参数

Table 2  Mass spectrometry parameters of microcystin

*表示定量离子

图2a  微囊藻毒素RR二级质谱图

Fig.2a  MS/MS spectra of microcystin RR 

图2b  微囊藻毒素YR二级质谱图

Fig.2b  MS/MS spectra of microcystin YR

图2c  微囊藻毒素LR二级质谱图

Fig.2c  MS/MS spectra of microcystin LR

1.3 样品处理

称取5 g样品，置于50 mL离心管中,加入25 mL甲醇提取液，涡旋混匀2 min，10℃下以9000 r/min 离心5 min；取上清液5.0 mL，加入40 mL水稀释，将提取液以1 mL /min 左右的流速通过C18固相萃取柱，待样液全部流出后，用3 mL水和3 mL 20%甲醇溶液淋洗，弃去全部流出液；用10 mL含有0.1%甲酸的甲醇溶液洗脱，以氮吹浓缩至近干，用1 mL 20%甲醇溶液溶解残渣，经高效液相色谱-串联质谱仪进行测定。 

2  结果讨论

2.1 质谱条件的优化

质谱多反应监测（MRM）有效克服了实际样品中的干扰组分较多，样品背景较脏的缺点，通过检测特定质荷比的碎片离子峰，可以获得更高的选择性和灵敏度，实现对目标物的准确定性定量。分别考察了电喷雾离子源( ESI)正、负离子模式检测3种微囊藻毒素的情况。结果表明，相对于负离子模式，采用正离子模式时3种微囊藻毒素均有较高响应，因此选择正离子模式进行检测。以0.5 μg/mL混合标准溶液，进行一级离子全扫描。通过优化雾化气流速、干燥气流速、脱溶剂管温度、加热模块温度等参数，从而获得有效的分子离子峰；再对各化合物对应的分子离子峰碰进行碎片离子扫描，所得质谱图如图2a、2b、2c所示。微囊藻毒素RR的二级碎片离子主要有135、105、323、486等，微囊藻毒素YR的二级碎片离子主要有135、103、474等，微囊藻毒素LR的二级碎片离子主要有135、482、374、417等。选取丰度最强的离子作为各组分的监测离子，优化碰撞能量等质谱参数，最终确定本方法的定量和定性离子及相应的质谱参数如表2所示。

2.2 色谱条件的选择

本方法考察了C8、C18、XR-ODS、BEH C18不同色谱柱的分离效果，发现XR-0DS色谱柱分离效果及目标物峰形最好。在采用XR-ODS色谱柱的基础上，比较了0.1%甲酸水/乙腈体系、0.1%甲酸水/甲醇体系、0.1%甲酸的甲酸铵溶液（5 mmol/L）/乙腈体系、0.1%甲酸的甲酸铵溶液（5 mmol/L）/甲醇体系、0.1%甲酸的甲酸铵溶液（5 mmol/L）/95%乙腈水溶液（含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵）体系、0.1%甲酸的甲酸铵溶液（5 mmol/L）/95%甲醇水溶液（含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵）体系作为流动相的分离效果，结果发现采用乙腈作为有机相的分离效果优于甲醇。由于质谱采用正离子进行检测，流动相中加入一定的酸，有助于促进目标化合物电离从而有利于离子化。实验发现在流动相中同时添加甲酸和甲酸铵，不仅有利于保持目标物较窄的峰形及保留时间的稳定，且有助于提高目标物在ESI正离子模式下的灵敏度，因此最终选定0.1%甲酸的甲酸铵溶液（5 mmol/L）和95%乙腈水溶液（含有0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵）作为本方法的流动相。比较了等度洗脱和梯度洗脱两种洗脱模式的分离效果，由于鱼肉中样品基质复杂，干扰杂质较多，为了提高样品分离度、缩短分析时间，最终选择梯度洗脱模式，使目标物获得更好的分离效果和响应，最大程度的避免杂质的干扰。

2.3 样品的提取及净化

微囊藻毒素易溶于甲醇、乙腈等溶剂，实验分别选择甲醇、乙腈作为提取剂。结果表明，用乙腈提取，回收率较低; 用甲醇提取效果最好，回收率高且基质干扰小，能够满足检测需求。因此，最终选择甲醇作为提取溶剂。

微囊藻毒素的净化一般采用C18和HLB固相萃取柱^[8-9]，实验发现这两种固相萃取柱对于微囊藻毒素均有较好的保留，最终采用C18 固相萃取柱进行净化。

2.4 线性关系、检出限和定量限

用空白基质液配制浓度为0, 0.20, 0.50, 1.00, 2.00, 5.00 μg /L的混合标准工作液，按仪器分析条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积比为纵坐标，外标法绘制标准工作曲线，结果如图3a、3b和3c所示。3种微囊藻毒素在检测浓度范围内线性良好，线性方程及相关系数见表3。检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别在定性离子色谱峰可有效识别的前提下，以实际样品和低水平加标样品各分析物的信噪比（Peak to Peak）约为3和10进行评估检出限和定量限，微囊藻毒素RR和LR的检出限为0.06 μg/kg，YR的检出限为0.03 μg/kg；微囊藻毒素RR和LR的定量限为0.2 μg/kg，YR的定量限为0.1 μg/kg。

图3a  微囊藻毒素RR的线性回归曲线

Fig.3a  Linear regression graph of microcystin RR

图3b  微囊藻毒素YR的线性回归曲线

Fig.3b  Linear regression graph of microcystin YR

图3c  微囊藻毒素LR的线性回归曲线

Fig.3c  Linear regression graph of microcystin LR

表3  3种微囊藻毒素的线性方程、相关系数（r）、检出限及定量限

Table 3  Linear equation, correlation coefficient（r）, LODs and LOQs of  three microcystins

2.5 回收率及精密度考察

对鱼类空白基质进行3浓度水平、6平行加标实验，微囊藻毒素RR和LR加标水平浓度为1.0、2.0和4.0 μg/kg；微囊藻毒素YR加标水平浓度为0.5、1.0和2.0 μg/kg。3种微囊藻毒素加标回收率及相对标准偏差见表4。在添加浓度范围内，3种微囊藻毒素的回收率在88.0%~102%之间，相对标准偏差在4.41%以内，准确性好。鱼肉加标样品的MRM谱图见图4。

表4  鱼空白基质中三种微囊藻毒素的回收率及相对标准偏差（n=6）

Table 4  Recovery and RSDs of three microcystins in fish blank matrix (n=6)

图4  鱼肉加标样品的MRM色谱图(微囊藻毒素RR和LR添加浓度1.0μg/kg,微囊藻毒素YR添加浓度0.5μg/kg)

Fig.4  MRM chromatograms of spiked fish samples  (with added concentrations of microcystin RR and LR were 1.0μg/kg, and that of microcystin YR was 0.5μg/kg)

2.6 实际样品的测定

为评价该方法的有效性，本实验测定了进出口及市售的30个鱼类样品，所有样品中3种微囊藻毒素均未检出。

3  结论

本文建立了一种高效液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中3种微囊藻毒素。3种微囊藻毒素RR、YR和LR在0.2~5.0 μg/L空白基质溶液系列工作液浓度范围内线性良好，相关系数大于等于0.999，方法对于3种微囊藻毒素的定量限均小于等于0.2 μg/kg；对鱼类空白基质进行3水平、6平行加标试验，回收率在88.0%~102%之间，相对标准偏差（RSD）在4.41%以内，准确性好。本方法操作简单、可行性强、回收率高、结果准确、检出限低，方法学各项技术指标均满足定性、定量分析要求，可实现鱼肉中微囊藻毒素的快速测定，用于进出口鱼类产品中微囊藻毒素的污染风险监控。

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第一作者：林伟坚（1990-），男，汉族，广东陆丰人，大学本科，助理工程师，主要从事食品中有毒有害物及营养成分检测工作，E-mail：305800178@qq.com

1.深圳海关食品检验检疫技术中心  深圳  518045

1. Food Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Customs, Shenzhen  518045 

参考文献

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（文章类别：CPST-A）