唐振涛¹ 于 刚² 何开蓉² 薛 康²

摘 要 基于磁性固相萃取技术，本文采用自制磁性氧化石墨烯提取分离苦荞茶基质中的4种黄曲霉毒素（黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂），并结合高效液相色谱-三重四级杆质谱，在多反应监测模式（MRM）下进行目标物的分析。通过对建立的磁性固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法进行考察，实验结果表明，4种黄曲霉毒素在线性范围内均有良好的线性关系，相关系数均大于0.9996（对于黄曲霉毒素B₁、B₂，线性范围为0.5 μg/L ~ 10 μg/L；黄曲霉毒素B₂、G₂，线性范围为0.125 μg/L ~ 2.5 μg/L），方法的检出限和定量限分别低至0.014 μg/L和0.046 μg/L，加标回收率范围为73.3% ~ 86.79%，RSDs（n=3）＜8%。该方法简便、可靠，具有较好的灵敏度和准确性，能有效用于苦荞茶中4种黄曲霉毒素的检测。

关键词 苦荞茶；黄曲霉毒素；磁性氧化石墨烯；磁性固相萃取；高效液相色谱-串联质谱

 Detection of Four Aflatoxins by Magnetic Solid-Phase Extraction- High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry 

TANG Zhen-Tao¹  YU Gang²  HE Kai-Rong²  XUE Kang²

Abstract Based on magnetic solid-Phase extraction technology, the in-house fabricated magnetic graphene oxide was applied to extract and isolate four aflatoxins (AFB₁, AFG₁, AFB₂, AFG₂) from buckwheat tea matrix. Then, the target analytes were analyzed by HPLC-MS/MS in multiple reaction monitoring (MRM) mode. According to the result of methodological investigation, the linear relationships of four aflatoxins were good in linear range (0.5 μg/L -10 μg/L for AFB₁, AFG₁, 0.125 μg/L- 2.5 μg/L for AFB₂, AFG₂). Detection limits (LOD) and quantification limits (LOQ) were respectively detected down to 0.014 μg/Land 0.046 μg/L. Recoveries were obtained ranging from 73.3% - 86.79% with RSDs（n=3）＜8%. The results demonstrated that the established method exhibited such advantages as simplicity, reliability, good sensitivity and accuracy. It is feasible and effective to apply this method for the determination of four aflatoxins in buckwheat tea.

Keywords buckwheat tea; aflatoxins; magnetic graphene oxide; magnetic solid-phase extraction; HPLC-MS/MS

基金项目：四川省科技项目（2018JY0427）

第一作者：唐振涛（1989-），女，藏族，四川人，讲师，博士，研究方向为中药分析，E-mail：zttang1@163.com

1. 成都中医药大学中医药创新研究院，四川成都  611137

2.成都海关技术中心，四川成都  610041

1. Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu  611137

2. Technology Center of Chengdu Customs District , Chengdu  610041

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次生代谢产物。因其具有很强的致畸性、致癌性和致突变性，被国际癌症研究机构（International Agency for Research on Cancer, IARC）确定为Ⅰ类致癌物^[1]。该类毒素可经过直接摄取或间接转移进入人体或动物，进而对人体或动物造成严重危害^[2]。因此，食品及饲料中黄曲霉毒素的污染一直是国际上尤为关注的食品安全问题之一^[3]。世界各国及相关组织对食品中黄曲霉毒素设定了限量标准，并不断加强对食品中黄曲霉毒素含量的监管及控制^[4]。对黄曲霉毒素进行监管，首先需要建立科学实用的分析方法。目前，黄曲霉毒素的检测方法主要包括色谱法、色谱质谱联用法以及免疫学方法等^[5-8]。灵敏、高效、高通量的分析方法为黄曲霉毒素的定性定量分析带来了新的机遇和挑战。

然而，作为分析复杂基质中痕量目标物的关键步骤之一，样品前处理对食品中黄曲霉毒素检测的准确性及灵敏性同样具有重要影响^[9]。这也属于目前真菌毒素分析的研究热点。固相萃取技术因其溶剂用量少、灵敏度高、易于实现自动化等优势，被广泛用于真菌毒素的分析^[8-9]。

近年来，随着固相萃取新方法以及新型吸附材料的发展^[10]，磁性固相萃取技术在真菌毒素的检测中表现出十分广阔的应用前景^[11]。磁性固相萃取技术是通过磁性吸附材料与样品基质混合，借助超声、震荡等实现目标分析物的吸附，然后通过外加磁场实现吸附材料与样品基质的分离，进而洗脱目标分析物，以待检测^[12]。相比于传统固相萃取方法，该方法省时省力，可以提高目标物的分析效率，又因吸附材料可重复利用而具有较低的分析成本。因此，为简化分析步骤，降低分析成本，本文通过自制磁性氧化石墨烯，结合磁性固相萃取与高效液相色谱-串联质谱法，建立了一种苦荞茶中4种黄曲霉毒素（黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂）的分析方法。

1  材料与方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-三重四级杆质谱（AB SCIEX 4500），色谱柱（SB-C18，150 mm × 2.1 mm × 3.5 μm，安捷伦科技有限公司），电子分析天平（XS205DU，梅特勒托利多仪器有限公司），涡旋混合器（XW-80A，上海沪西分析仪器有限公司），离心机（3K30，德国Sigma公司），高速粉碎机（德国IKA公司），尼龙针式滤头（0.22μm，天津津腾实验设备有限公司）。

黄曲霉毒素混合对照品（奥地利Biopure公司），C18（成都思为科学仪器有限公司），氧化石墨烯（上海源叶生物科技有限公司），甲醇、乙腈（HPLC级，美国Fisher Scientific公司），无水MgSO₄、NaCl、FeCl₃.6H₂O、乙酸钠、柠檬酸钠、乙二醇、聚乙二醇（分析纯，上海麦克林生化科技有限公司）。

1.2 磁性氧化石墨烯的制备

Fe₃O₄的制备：称取6.8 g FeCl₃.6H₂O，18 g乙酸钠，快速加入250 mL乙二醇，搅拌30 min，使其溶解。将溶液倒入反应釜，于200 ℃下反应8 h。产物经磁分离，用乙醇、去离子水轮流洗涤3次，烘干备用。

Fe₃O₄@GO的制备：将0.15 g 氧化石墨烯（GO）分散于40 mL 乙二醇。然后，加入0.4 g FeCl₃.6H₂O，0.15 g 柠檬酸钠，1.8 g 乙酸钠，1.8 g 聚乙二醇，搅拌1 h。将混合溶液倒入反应釜，于200℃下反应12 h。产物经磁分离，用乙醇、去离子水轮流洗涤3次，烘干备用。

1.3 待测溶液的配制

1.3.1 标准溶液的配制

标准储备溶液：于-20℃避光保存，备用。

标准工作溶液：准确移取相应体积的标准储备液于10 mL容量瓶中，乙腈定容。逐级稀释，配制AFB₁、AFG₁浓度为： 0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、2.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL；AFB₂、AFG₂浓度为0.125 ng/mL、0.25 ng/mL、0.5 ng/mL、1.25 ng/mL、2.5 ng/mL。

1.3.2 样品前处理

样品制备：采集1 kg以上的样品，用高速粉碎机将其粉碎，过筛。混合均匀后缩分至100 g，密封冷藏保存，供检测用。

样品提取：取2 g（精确至0.01 g）样品粉末于50 mL离心管中，加入20 mL甲醇-水溶液（体积比为3∶1），涡旋混匀，超声20 min。然后在10000 r/min的速度下离心5 min，取上清液备用。

样品净化：在10 mL提取液中快速加入2 g无水MgSO4和1 g NaCl，涡旋1 min后离心。取2 mL上层溶液，用30 mg C18涡旋净化1 min后，准确移取1 mL并加入9 mL去离子水，涡旋混匀。加入10 mg磁性氧化石墨烯，涡旋12 min；通过磁铁外加磁场将吸附材料与溶液分离，弃去溶液（吸附过程如图1所示）。再通过1 mL甲醇解吸磁性氧化石墨烯的吸附成分，经磁分离，收集甲醇溶液。重复上述解吸步骤，将两次甲醇溶液混合，氮吹至近干。加入1 mL初始流动相，涡旋1 min。最后用0.22 μm滤膜过滤待测液，收集至进样瓶，待检测。

1.4 仪器分析条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱：C18柱（柱长150 mm，柱内径2.1 mm，填料粒径3.5 μm）；流动相：0.2%甲酸溶液（A），乙腈（B）；流速：0.25 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；梯度洗脱程序见表1。

1.4.2 质谱采集参数

质谱配备电喷雾离子源（150 ℃，正离子采集模式）；检测方式：多反应监测模式（MRM）；毛细管电压：3.5 kV；锥孔电压：30 V；脱溶剂气温度及流速：500 ℃，800 L/h；雾化气流速：150 L/h；目标化合物物的采集参数（包括监测离子对，碰撞电压，去簇电压）见表2。

图1  磁性氧化石墨烯分离目标成分的过程

Fig.1  Separation procedure of the target analytes by magnetic graphene oxide

表1  测定4种黄曲霉毒素的梯度洗脱程序

Table 1  Gradient elution program of 4 aflatoxins

2  结果与分析

2.1 磁性氧化石墨烯的红外表征

对制备的磁性氧化石墨烯（Fe₃O₄@GO）进行红外表征，并将其与Fe₃O₄，GO进行比较。对于Fe₃O₄@GO 而言，3400 cm^-1处强而宽的峰为O-H伸缩振动峰。2923 cm^-1吸收峰为C-H伸缩振动峰。1637 cm^-1为O-H的弯曲振动峰。1381 cm^-1为C=O的弯曲振动峰。1178 cm^-1为羧基基团的C-O伸缩振动峰。602 cm^-1附近的吸收峰为 Fe-O-Fe 伸缩振动峰。另外，根据三种材料的谱图对比，可以看出Fe₃O₄@GO同时具有Fe₃O₄和GO的特征吸收峰。以上实验结果说明成功制备了磁性氧化石墨烯。

2.2 实验条件的优化

2.2.1 仪器参数的优化

为使目标分析物具有较好的分离效果和响应，分别对流动相、流动相梯度，质谱采集参数进行了优化。优化后的参数见表1、表2。

2.2.2 样品前处理的优化

为了保证方法的灵敏度和回收率，实验考察了吸附时间和解吸次数对分析结果的影响。首先，比较了不同的吸附时间（5 min、7 min、10 min、12 min、15 min）。结果表明，目标分析物在吸附12 min及15 min后可以得到比较稳定的回收率。此外，解吸次数对目标物的回收率同样具有重要影响。针对同一空白加标样，经过Fe₃O₄@GO处理后，依次解吸三次并分别进行检测。结果表明，第三次解吸溶液几乎没有目标分析物的响应信号。因此，最终选择的吸附时间为12 min，解吸次数为2次。

2.3 线性关系、检出限/定量限的考察

为了消除基质效应，采用不含黄曲霉毒素的苦荞茶样品，通过建立样品前处理方法制备空白基质溶液。然后在空白基质液中加入相应量的黄曲霉毒素标准品，制备基质匹配标准溶液，进而建立校准曲线。

以目标化合物的色谱峰峰面积为纵坐标，溶液浓度为横坐标，进行线性回归分析。分别以最低浓度点计算方法的检出限（LOD，3倍信噪比）和定量限（LOQ，10倍信噪比）。建立方法的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量限见表3。

表2  4种黄曲霉毒素的质谱采集参数

Table 2  Mass spectrometry acquisition parameters of 4 aflatoxins

表3  方法的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

Table 3  The linear range, regression equations, correlation coefficients, detection limits and quantification limits of the established method

2.4 回收率及重现性试验

取6份空白样品，分别加入一定量混合标准溶液，得到两个浓度级别的加标样（AFB₁、AFG₁为0.5 ng/mL和5 ng/mL；AFB₂、AFG₂为0.125 ng/mL和1.25 ng/mL），每个加标浓度平行3份。通过建立的方法制备并测定加标样，计算4种黄曲霉毒素的平均回收率和相对标准偏差，结果见表4，方法的平均回收率为73.30% ~ 86.79%，相对标准偏差为1.83% ~ 7.19%。结果表明，建立的方法具有较好的准确性和重现性。

2.5 实际样品的考察

将建立的方法应用于苦荞茶中4种黄曲霉毒素的检测，随机取市售苦荞茶样品33份，按上述方法进行测定。结果表明，黄曲霉素B₁的含量均未超出GB 2761-2017规定的限量值（限量5.0 μg/kg）^［13］。其中，黄曲霉毒素G₁、G₂均未被检测到；26份样品检出黄曲霉毒素B₁（含量为0.019 ~ 0.077 μg/kg）；2份样品检出黄曲霉毒素B₂（含量分别为0.016和0.030 μg/kg）。

表4  方法的回收率和相对标准偏差

Table 4  The recoveries and RSDs of the established method

3  结论

本文通过成功制备磁性氧化石墨烯，并将其用于苦荞茶中4种黄曲霉毒素的提取分离。同时，通过结合磁性固相萃取与高效液相色谱-串联质谱实现目标真菌毒素的分析。实验结果表明，基于磁性固相萃取建立样品前处理方法，不仅简化了分析步骤，同时保证了分析方法的灵敏性及准确性。另外，通过自制磁性吸附材料，能有效降低分析成本。总的来说，该方法简便、可靠，具有较好的灵敏度和准确性，能有效用于苦荞茶中4种黄曲霉毒素的检测，也可为其他基质中黄曲霉毒素的检测提供参考。

【该文经CNKI学术不端文献检测系统检测，总文字复制比为6.4%。】

参考文献

[1] International Agency for Research on Cancer; IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. International Agency for Research on Cancer: Lyon, France 1993, 56.

[2]吴丹. 黄曲霉毒素在粮食和食品中的危害及防治[J].粮食加工, 2007, (3): 91-94.

[3] Stoev, Stoycho D.; Foodborne mycotoxicoses, risk assessment and underestimated hazard of masked mycotoxins and joint mycotoxin effects or interaction[J]. Environmental toxicology and pharmacology, 2015, 39 (2): 794-809.

[4]尚艳娥, 杨卫民. CAC、欧盟、美国与中国粮食中真菌毒素限量标准的差异分析[J]. Journal of Food ence and Technology, 2019, 37 (1): 10-15.

[5]李蓉, 黄莹偲, 王勇, 等. 食品中真菌毒素检测技术的研究进展[J]. 中国卫生检验杂志, 2015, 25: 3195-3198.

[6]李少晖, 任丹丹, 谢云峰, 等. 食品中黄曲霉毒素检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报, 2015, 6 (4): 1107-1115.

[7] Laura Anfossi, Cristina Giovannoli, Claudio Baggiani; Mycotoxin detection[J]. Current opinion in biotechnology, 2016, 37: 120-126.

[8] Zhang Lei, Dou Xiaowen, Zhang Cheng, etc.; A Review of Current Methods for Analysis of Mycotoxins in Herbal Medicines[J]. Toxins, 2018, 10 (2): 65-103.

[9]韦芳, 廖晓芳, 刘晓菲, 等. 中药材等复杂基质中真菌毒素检测的前处理技术研究新进展[J]. 中国中药杂志, 2018, 43 (17): 3431-3443.

[10] Justyna Płotka-Wasylka, Natalia Szczepanska, Miguel de la Guardia, etc.; Modern trends in solid phase extraction: New sorbent media[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2016, 77: 23-43.

[11]赵仁勇, 安娟, 崔文航, 等. 磁性固相萃取技术在真菌毒素检测中的应用研究进展[J]. 河南工业大学学报, 2017, 38: 118-126.

[12] Marta Wierucka, Marek Biziuk; Application of magnetic nanoparticles for magnetic solid-phase extraction in preparing biological, environmental and food samples[J].Trends in Analytical Chemistry, 2014, 59: 50-58.

[13]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会, 国家食品药品监督管理总局. GB 2761-2017：食品中真菌毒素限量[S]. 北京, 中国标准出版社, 2017.

（文章类别：CPST-B）