蜂蜜中蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的检测方法研究-中国口岸科学技术-2020年09期

蜂蜜中蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的检测方法研究

作者：杨东来1 刘玮琦1 刘丹1 彭菲1

杨东来¹ 刘玮琦¹ 刘丹¹ 彭菲¹

摘要蜜蜂欧洲幼虫腐臭病是世界上最严重的蜜蜂病害之一，病原体主要是蜂房蜜蜂球菌。我国现有检测标准和文献中关于检测蜂蜜中蜂房蜜蜂球菌的方法很少，本研究是在蜂蜜中检测蜜蜂欧洲幼虫腐臭病，将微生物培养法和PCR法结合，改进了对病原菌的培养和分离，再用PCR法定性鉴别，降低了检出限，提高了检测的准确性。

关键词 欧洲幼虫腐臭病；蜂房蜜蜂球菌；蜂蜜；检测

A Study on the Detection Method of European Foulbrood Disease in Honey

YANG Dong-Lai¹ LIU Wei-Qi¹ LIU Dan¹ PENG Fei¹

Abstract European larva foulbrood disease of honeybees is one of the most serious bee diseases in the world. The main pathogen is Melissococcus plutonius. There are few effective methods to detect Melissococcus plutonius in honey in the existing test standards and literature. This study looks into the detection of Melissococcus plutonius in honey with microbial culture and PCR, which has improved the culture and isolation of pathogenic bacteria. PCR is then used in qualitative identification, to reduce the detection line and improve the accuracy of detection.

Keywords European foulbrood disease; Melissococcus plutonius; honey; detection

蜜蜂欧洲幼虫腐臭病^[1]（European foulbrood disease）是世界上最严重的蜜蜂病害之一，为细菌感染的一种常见蜜蜂疾病，其致病菌是蜂房蜜蜂球菌、变异蜜蜂链球菌、蜂房芽孢杆菌、粪肠球菌等^[2-3]。蜂房蜜蜂球菌是蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的主要致病菌，其他细菌为次生菌，有辅助致病的作用，因此欧洲幼虫腐臭病检测的是蜂房蜜蜂球菌。

蜂房蜜蜂球菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，菌体大小为0.5μm×1.0μm，菌体单个或成对，有时成链状排列，个体形状为圆形、披针样，无芽孢，无鞭毛；菌落形态为边缘整齐，表面光滑的圆形，颜色为淡黄色或白色。该菌对外界环境适应性强，在蜂蜜中可存活1年，最长能存活3年。50 mL/m³福尔马林蒸气，40℃，需3 h才可杀死。

蜜蜂欧洲幼虫腐臭病被世界动物卫生组织（OIE）定为二类动物疫病，中华蜜蜂和西方蜜蜂都易感，主要感染蜜蜂幼虫，不感染成年蜜蜂。蜂房蜜蜂球菌主要侵害1～2日龄幼蜂的消化系统，多在3～4日龄未封盖时死亡，死亡的虫体有酸臭味，尸体先呈现白色或浅黄色，干燥后变成褐色。蜜蜂欧洲幼虫腐臭病在世界上分布较为广泛，欧美各国都是疫区，我国每年的进口货物中都有检出。我国中蜂发生该病较为普遍，且多发生于春秋两季，秋季病情较轻，夏季少发，影响春繁和秋繁，传播迅速、发病快。染病的幼蜂及污染的环境是主要传染源，成年工蜂在活动中成为传播者，有时养蜂者在喂食和清理中也会传播。

检测蜜蜂欧洲幼虫腐臭病当前常用方法是以蜜蜂虫体作为检测目标来检测蜂房蜜蜂球菌，即直接对蜜蜂的成虫或幼虫虫体进行取样处理及检测。检测方法有症状诊断法、微生物学诊断法、生化诊断法、核酸检测法等^[4-7]。其中，核酸检测法是对蜂房蜜蜂球菌检测常用的方法，即将虫体直接绞碎，提取核酸，核酸扩增，电泳，检查有无目的性特异性条带，判断是否感染蜂房蜜蜂球菌。

现有的方法都不适用于检测蜂蜜中的蜂房蜜蜂球菌，比如，核酸PCR法直接用于检测蜂蜜中的蜂房蜜蜂球菌有着很大的局限性，因为现在大多数商品化的蜂蜜，为了保证好的观感，在灌装前都经过过滤处理，将蜂蜜中的杂质包括幼蜂的虫体都被过滤掉，蜂蜜中很难找到蜜蜂的虫体，所以无法实现用蜜蜂虫体检测蜂房蜜蜂球菌^[8]。有些文献是取蜂蜜当作样品，对蜂蜜直接提取核酸，进行检测。由于蜂蜜黏稠，蜂房蜜蜂球菌在其中分布不均匀，每个单位蜂蜜中蜂房蜜蜂球菌数量都不同，不能保证每次抽取蜂蜜样品中都有菌体存在，造成检测结果的不稳定。

本文所述欧洲幼虫腐臭病的检测方法主要适用于检测蜂蜜中蜂房蜜蜂球菌，是根据蜂蜜样品的特殊性，利用微生物培养法，对蜂房蜜蜂球菌培养分离；再用核酸法提取DNA，进行特异性检测。将微生物诊断法和PCR法结合到一起，提高了检测结果的稳定性和准确性。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株蜂房蜜蜂球菌，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。

1.1.2 主要试剂

培养基购自北京陆桥；核酸提取试剂盒和PCR扩增试剂盒均购自上海生工；引物购自上海生工，正向：5'-GAA GAG GAG TTA AAA GGC GC-3',反向：5'-TTA TCT CAA GGC GTT CAA AGG -3'，PCR产物大小为829bp^[5]。

1.1.3 主要设备 CO₂培养箱：美国Thermo371型； PCR仪：Biometra TADVANCED；琼脂糖凝胶电泳仪：DYY-6C型北京六一仪器厂；凝胶成像系统：美国伯乐 Gel Doc XR+。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌的分离

取蜂蜜样品100 g，45℃水浴，待蜂蜜的黏稠度降低，搅拌均匀，从中称取20 mL蜂蜜样品加入20 mL无菌生理盐水，涡旋混匀。

1.2.2 病原菌的培养

取上述处理的蜂蜜样品1 mL加入到培养平板中，倒入牛肉膏琼脂培养基（牛肉膏1 g，蛋白胨1 g，氯化钠0.5 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL，pH7.0，将上述各种成分混合，120℃高压灭菌15 min，使用时放冷到45℃左右）15 mL，摇匀，凝固后放置于5%的CO₂培养箱中培养，37℃条件下培养24～48 h，观察培养皿中菌落的生长情况^[4]。

1.2.3 菌落收集

上步培养平板中有菌落生长时，观察菌落特征。对疑似蜂房蜜蜂球菌菌落用小药匙或接种针等适合工具收集放入5 mL离心管中，加入2 mL无菌生理盐水，涡旋混匀。

1.2.4 PCR检测

取上步混匀菌液200μL，使用核酸提取试剂盒，按照其操作步骤，提取DNA；按照PCR扩增试剂盒操作步骤及反应条件，取上述提取DNA溶液5μL作为模板，反应体积25μl，配制反应液，放入PCR仪扩增；PCR反应结束后取6μL产物，进行琼脂糖凝胶电泳，最后凝胶块用紫外凝胶成像系统观察有无目的条带^[5]。

2 结果判定

2.1 当1.2.2培养皿中没有菌落生长，直接判断为没有检测到蜂房蜜蜂球菌，欧洲幼虫腐臭病为阴性。

2.2 当在琼脂糖凝胶电泳结果中829bp处没有目的条带，则判断为没有检测到蜂房蜜蜂球菌，欧洲幼虫腐臭病为阴性。

2.3 在琼脂糖凝胶电泳结果中829bp处有目的条带，则判断为检测到蜂房蜜蜂球菌，欧洲幼虫腐臭病为阳性。

3 不同检测方法检测欧洲幼虫腐臭病的利弊

现有检测方法都是把蜜蜂虫体作为样品，来检测蜂房蜜蜂球菌，还没有以蜂蜜为样品来检测蜂房球菌的检测方法。以蜂蜜和虫体为样品检测是有着本质的区别，蜂房蜜蜂球菌主要存在于蜜蜂虫体中，病原菌集中，现有的检测方法都适合检测。蜂蜜中的蜂房蜜蜂球菌主要是染病蜜蜂虫体污染所致，蜂蜜中的病原菌数量比虫体中的数量少很多。另外，蜂蜜性状有着特殊性，无论是微生物法还是PCR法等检测方法单独在蜂蜜中检测欧洲幼虫腐臭病都有不足。本文的检测方法是在原有的检测标准方法的基础上进行了改进，将微生物培养法和PCR诊断法相结合，确保了检测的准确性和稳定性，改进检测方法能更好地适用于在蜂蜜中检测蜂房球菌。

3.1 微生物诊断法

微生物诊断法是检测蜂房蜜蜂球菌的常用方法。操作过程是直接将虫体绞碎，放入培养基中培养，镜检观察菌落菌体形态，判断结果^[4]。该方法主观性强，对检测经验要求高，同时应用此法在分离培养中很容易出现杂菌，已知培养中常见的杂菌有蜜蜂链球菌、蜂房芽孢杆菌、腐败细菌、侧芽孢杆菌、粪链球菌及变异性蜜蜂链球菌等^[4]，这些次生菌中一些和蜂房球菌形态学相近，镜检很难区分，这将大大增加了鉴别的难度，在检测鉴别中很容易出现错误。

3.2 PCR技术鉴定法

随着基因检测技术的发展，PCR技术成为了生物学鉴定的重要方法，是欧洲幼虫腐臭病最常用的方法。其操作是挑取发病虫体提取DNA，然后用PCR扩增，再进行琼脂糖凝胶电泳，观察有无目的条带。蜂蜜有着特殊的形态，黏稠度很高，流动性性很差，导致微生物在蜂蜜中分布不均匀。按照现有基因提取技术直接对蜂蜜提取DNA时，面临的问题是当菌体在蜂蜜中浓度分布不均和菌体浓度小于一定程度时，无法保证能有效地提取到菌体DNA，很容易出现漏检的问题，所以直接使用PCR方法检测容易出现误检和结果不稳定的问题。

3.3 微生物培养法和PCR诊断法相结合

将微生物培养法和PCR诊断法相结合，弥补了上述单独检测的不足，保证了检测结果的准确性，又能提高检测稳定性。首先利用微生物培养能够增加取样量（多平行取样培养），通过培养后挑取菌落，进行菌体分离和扩增菌体数量，这样通过微生物培养获得菌体的几率会大大提高，降低蜂蜜中检测菌体浓度要求，然后利用核酸提取技术对收取的菌落提取DNA，再利用PCR扩增技术确诊。本文的检测方法解决了微生物培养法和PCR诊断法的不足，适用于蜂蜜中欧洲幼虫腐臭病的检测。

图1 琼脂糖凝胶电泳结果

Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis

3.4 各种检测方法的验证

为了验证本文检测方法的优势，把蜂房蜜蜂球菌菌液稀释，用琼脂平板法计数^[9]确定菌液的浓度，再将菌液进行梯度稀释，将不同浓度的菌液添加到无菌蜂蜜样品中，计算蜂蜜中蜂房蜜蜂球菌的浓度，得到含有不同菌体浓度的蜂蜜样品，用本文方法和单独PCR方法检测，结果如图（M：DNA Markers 2000；泳道1：无菌蜂蜜空白对照；泳道2～4：本文方法提取DNA电泳结果，蜂房蜜蜂球菌浓度分别为400cfu/mL、100cfu/mL、50cfu/mL；泳道5～6为直接在蜂蜜中提取DNA电泳结果，蜂房蜜蜂球菌浓度分别为300cfu/mL、200cfu/mL）。用本文的检测方法先进行微生物培养再用PCR技术检测，当蜂蜜中蜂房蜜蜂球菌的数量大于100cfu/mL时，检测结果准确，当小于这个浓度时，检测结果不稳定，检测不到蜂房球菌。直接在蜂蜜中提取DNA和PCR，当蜂蜜中菌体的浓度大于300cfu/mL时，才能准确地检测到蜂房蜜蜂球菌，当蜂蜜中菌体数量低于这个浓度时，检测结果不稳定，检测不到蜂房蜜蜂球菌。改进后的检测蜂蜜中蜂房蜜蜂球菌的方法无论是结果的稳定性，还是菌体最低检测浓度都要比其他的检测方法好。