王 宇¹ 张 慧¹ 韩 伟¹ 万璐璐¹ 崔淑华¹ 程 刚¹

摘 要 本研究建立了液相色谱-串联质谱法测定食品中乙基多杀菌素残留量的分析方法。样品经乙腈提取，通过基质分散萃取净化后，外标法定量。本研究优化了前处理流程，考察了不同净化剂的净化效果，选择C₁₈+PSA作为净化剂。结果表明：在0.2 μg/L～50 μg/L范围内，乙基多杀菌素响应线性关系良好，线性相关系数大于0.999，定量限可至0.005 mg/kg；针对不同种类的动物及植物源性样品基质，前处理过程净化效果良好，在LOQ、MRL、2倍MRL3个添加水平下，平均回收率80.8%～112.5%，相对标准偏差4.2%～8.9%。本方法快速简便，定性定量准确，能够满足食品中乙基多杀菌素残留的检测需要。

关键词 乙基多杀菌素；动物源性食品；植物源性食品；液相色谱-串联质谱；基质分散萃取

 Determination of Spinetoram Residuals in Foods by HPLC-MS/MS

WANG Yu¹  ZHANG Hui¹  HAN Wei¹  WAN Lu-Lu¹  CUI Shu-Hua¹  CHENG Gang¹

Abstract A method based on matrix solid-phase dispersion (MSPD) and HPLC-MS/MS was developed for the determination of spinetoram residuals in foods. The samples were extracted with acetonitrile , purified with C₁₈+PSA, and quantified by external standards. The pretreatment process was optimized and the purification effects of purification agents were investigated. According to the results of experiments, the correlation coefficients of calibration curves were over 0.999 in 0.2 μg/L～50 μg/L, and the limits of quantification(LOD) were 0.005 mg/kg. For different kinds of animal- and plant-origin samples, the purification effect was good. The average recovery rates were 80.8%～112.5% and the relative standard deviations were 4.2%～8.9% under three addition levels of LOQ, MRL and double MRL. As the method is simple, efficient and accurate, it can meet the need of detecting spinetoram residuals in foods.

Keywords spinetoram; animal-origin foods; plant-origin foods; HPLC-MS/MS; matrix solid-phase dispersion

乙基多杀菌素（spinetoram）是由美国陶氏益农公司出品的一种新型多杀菌素（spinasad）类杀虫剂，常见商品名为艾绿士 ，该药剂包括主要成分XDE-175-J（C₄₂H₆₉NO₁₀，748.0，CAS No.187166-40-1）和次要成分XDE-175-L（C₄₃H₆₉NO₁₀，760.0，CAS No.187166-15-0），一般主要成分为70%～90%，次要成分为10%～30%。该农药可通过胃毒和触杀作用有效控制苹果蠹蛾、小菜蛾、甜菜夜蛾、蓟马、潜叶蝇等鳞翅目和缨翅目害虫，田间喷雾持效时间为7 d左右；对鸟类、鱼类、蚯蚓、蜜蜂、水生植物等低毒，环境安全性好，适用于有害生物综合治理，目前已广泛使用。

2012年，香港特别行政区立法会通过第73号法律公告《食物内除害剂残余规例》^[1]，规定了乙基多杀菌素在水果、蔬菜、木本坚果、奶类、奶脂、哺乳类动物的肉及可食用内脏中的最高残余限量，在0.01 mg/kg～10 mg/kg之间。在我国食品安全国家标准GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中^[2]，规定了乙基多杀菌素在谷物、蔬菜、水果、坚果和糖料中的最大残留临时限量，在0.01 mg/kg～10 mg/kg。

目前，我国尚未制定食品及农产品中乙基多杀菌素残留量检测的标准方法，吴琼^[3]、钱程^[4]、张晓燕^[5]、傅强^[6]、李刚^[7]、牛艳^[8]、Ruiz^[9]、Malhat^[10]、许美玲^[11]、胡江涛^[12]等研究者使用QuEChERS前处理技术和液相色谱-串联质谱仪分别建立了土壤、蔬菜、粮谷和中药材等样品中的乙基多杀菌素及其他种类农药的残留检测方法，均具有良好的实际使用效果。

本研究采用QuEChERS法进行样品前处理，HPLC-MS/MS进行检测，对不同植物源性和动物源性食品的前处理流程进行优化，考察不同净化剂的净化效果，建立了不同种类食品中乙基多杀菌素残留量的测定方法，并对方法性能进行验证，以期为食品安全相关研究提供参考。

1  材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈、甲酸、正己烷（均为色谱纯，德国Merck公司）；无水硫酸镁、氯化钠（均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅胶键合相（C₁₈）、石墨化炭黑（Carb）、氨丙基（NH₂）（基质分散固相萃取剂，美国Agilent公司）；乙基多杀菌素标准物质（主要成分XDE-175-J、次要成分XDE-175-L，纯度97.5%，德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）。

1.2 仪器与设备

1290-6460B型液相色谱-串联质谱仪，配ESI离子源和三重四级杆检测器（美国Agilent公司）；精密分析天平、粉碎机、均质器、涡旋混合器、高速离心机等实验室常用设备。

1.3 前处理方法

1.3.1 水果、蔬菜类样品的提取

称取10 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，准确加入20 mL乙腈，均质提取1 min后加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠，涡旋振荡2 min，7000 r/min离心5 min后，待净化。

1.3.2 木本坚果类样品的提取

称取5 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加5 mL～10 mL水混匀，放置30 min。准确加入20 mL乙腈，均质提取1 min后加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠，涡旋振荡2 min，7000 r/min离心5 min后，待净化。

1.3.3 奶类、奶脂类样品的提取

称取5 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加5 mL～10 mL水混匀，准确加入20 mL乙腈，涡旋振荡提取1 min。加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠，涡旋振荡2 min，7000 r/min离心5 min。准确移取10 mL乙腈层至另一离心管中，加入10 mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡1 min后弃去己烷层，再加入10 mL乙腈饱和正己烷重复操作一次，待净化。

1.3.4 肉、可食用内脏类样品的提取

称取5 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加5 mL～10 mL水混匀，放置30 min。准确加入20 mL乙腈，涡旋振荡提取1 min。加入4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠，涡旋振荡2 min，7000 r/min离心5 min。准确移取10 mL乙腈层至另一离心管中，加入10 mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡1 min后弃去己烷层，再加入10 mL乙腈饱和正己烷重复操作一次，待净化。

1.3.5 提取液净化

称取0.15 g无水硫酸镁、0.05 g PSA和0.1 g C₁₈置于10 mL离心管中，移入2 mL提取液，涡旋1 min，7000 r/min离心5 min。取上清液过0.22 μm有机滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 液相色谱参数

(1) 色谱柱：Waters Atlantis^® T3（2.1 mm×150 mm，3 μm）；

(2) 流动相：乙腈（A），0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱条件如表1所示;

表1  液相色谱洗脱条件

Table 1  HPLC gradient elution conditions

(3) 进样量：5 μL；

(4) 柱温：30 ℃；

(5) 流速：0.3 mL/min。

1.4.2 质谱参数

(1) 离子源：电喷雾离子源（ESI）；

(2) 扫描方式：正离子扫描；

(3) 监测方式：多重反应监测（MRM）；

(4) 其他质谱参数如表2和表3所示。

表2  离子源参数

Table 3  Ion source parameters

表3  乙基多杀菌素质谱采集参数

Table 3  Mass spectrum parameters of spinetoram

注：*为定量离子

2  结果与分析

2.1 代表性样品基质的选择

根据GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》《食物内除害剂残余规例》要求，食物中乙基多杀菌素残余限量可按食物类型分为植物源性和动物源性两类。本研究选择甜橙、板栗、叶用莴苣、番茄、鲜牛奶、猪肉作为代表性样品基质，该批样品均购自超市，经检测乙基多杀菌素残留量为阴性。向经1.3过程前处理的阴性样品中，使用乙基多杀菌素标准溶液按0.02 mg/Kg水平作标准添加并使之混合均匀，作为加标样品。

2.2 样品前处理方法的优化

2.2.1 提取条件的选择

乙基多杀菌素属于常规农药，对酸和碱都不敏感，提取溶剂无需使用缓冲体系。常用的农药残留检测提取溶剂中，采用乙腈提取可利用盐析效应去除水分，同时考虑到对常用净化剂净化效果的影响，选择使用乙腈作为提取溶剂。

按照高含水率植物源样品、低含水率植物源样品、奶脂及奶类样品、肉类样品的区分，对木本坚果、肉类样品称样量减半并进行复水处理，对奶类、肉类样品进行乙腈饱和正己烷脱脂处理。

使用20 mL乙腈对10 g样品进行均质提取时，分别加入不同量的氯化钠、无水硫酸镁，考察氯化钠+无水硫酸镁对乙腈提取液体积的影响。试验表明，加入氯化钠均质提取的样品液中不含有水分，而仅加入无水硫酸镁提取时乙腈提取液中含有一定量的水。考虑到无水硫酸镁的去水放热反应可以加速相之间的分离，确定乙腈均质提取时加入4 g无水硫酸镁+1 g氯化钠。

动物源产品中部分脂类干扰物会溶于乙腈，污染色谱柱并干扰质谱电离。为去除基质中的脂类干扰物，本标准采用乙腈饱和正己烷萃取去脂处理，可去除样液中的大部分脂类干扰物。

2.2.2 净化条件的选择

本研究采用以基质分散固相萃取净化技术为基础的QuEChERS技术，常用的基质分散固相萃取吸附剂有乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅胶键合相（C₁₈）、石墨化炭黑（Carb）和氨丙基（NH₂）。为保证试验材料均一度，均采用安捷伦QuEChERS技术商品。PSA与NH₂具有相同性质，常用于去除各种有机酸、部分色素以及蛋白质、糖类，但由于PSA具有两个氨基吸附能力更强，因此一般较少使用NH2；C₁₈与Carb可以吸附样品中的蛋白、脂质物质、部分维生素、色素和甾醇等杂质高分子量的非极性干扰物质，特别适用于高脂类样品的净化。

考察了4个种类及质量配比的净化剂：(1) 150 mg PSA；(2) 150 mg C₁₈；(3) 150 mgPSA+ 150 mg C₁₈；(4)150 mg PSA + 45 mg Carb。分别使用浓度为0.02 mg/kg的6 mL乙腈标准溶液和6 mL阴性番茄甜橙混合基质标准溶液进行净化实验，回收率结果如表4所示。结果表明：4种净化剂对乙腈标准溶液中乙基多杀菌素吸附较强，特别是C₁₈的回收率很低；但使用基质标准进行实验时未见强吸附现象，分析原因认为PSA、C₁₈吸附剂上存在很多活性位点，使用基质标准时吸附剂上的活性位点被基质占据，不会再对目标物产生吸附作用。4种净化剂中，PSA+ C₁₈的净化效果最优，回收率更高，故选择PSA+C₁₈作为净化剂。

对净化剂使用量进行考察时发现：每毫升提取液中PSA添加量超过25 mg时，回收率会显著降低；每毫升提取液中C₁₈添加量只要不超过50 mg，都不会对乙基多杀菌素产生强吸附。故选择在每毫升提取液中加入25 mg PSA + 50 mg C₁₈对样品提取液进行净化。

表4  不同净化剂及标准溶液类型的影响

Table 4  Effects of different types of purifying agents and solvents

2.2.3 样品基质效应的消除

采用高效液相色谱-串联质谱的ESI源进行检测时，一般会存在基质减弱效应。试验发现，样品基质不同，产生的基质效应也不一样，较干净的果蔬类样品基质对农药离子化影响较弱，基质效应也较弱；奶类和肉类等相对复杂的样品基质对农药离子化影响较强，基质效应也较强。使用不含乙基多杀菌素的空白样品提取净化液作为标准溶液的稀释溶剂，可使标准溶液和样品溶液具有同样的离子化条件，从而消除样品基质效应。

2.3 仪器测定条件的优化

2.3.1 质谱测定条件的优化

乙基多杀菌素包括XDE-175-J和XDE-175-L两种成分，购买的商品化标准物质为两种成分的混合物。仪器测定时分别对两成分进行条件优化，使用两成分含量之和进行定量计算。

使用乙基多杀菌素标准溶液以流动注射的方式分别用ESI正离子和负离子模式进行全扫描，发现目标化合物在正离子模式下的响应明显高于负离子模式，故选择正离子模式，并确定其两种成分的母离子。另对毛细管出口电压/裂解电压进行优化，确定子离子并分别对其碰撞能量、毛细管电压、雾化气压力、干燥气温度、干燥气流速等参数进行优化，使目标化合物的离子化效率达到最佳。

2.3.2 色谱条件的优化

使用液相色谱-串联质谱进行农药残留分析时，通常选择甲醇、乙腈和水作为液相色谱流动相，并在其中加入低浓度的缓冲盐以形成有利于目标化合物离子化的溶液环境，可使色谱峰形对称、尖锐，改善分离度，提高灵敏度。本研究以安捷伦Eclipse plus C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、SB- C₁₈柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Thermo Gold柱（100 mm ×2.1 mm，3.0 μm）和Waters Atlantis^® T3柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）4种色谱柱为分离环境，分别以甲醇、乙腈为有机相，以甲酸-水溶液、乙酸铵-水溶液为水相，对乙基多杀菌素响应情况进行考察，结果表明：使用乙酸铵缓冲体系时，目标物无法被完全洗脱，进样重复性很差；使用甲酸缓冲体系时，不存在强吸附现象，目标物保留时间及分离度均能得到理想结果；与乙腈相比，以甲醇为有机流动相可导致目标物响应值显著降低。故选择使用乙腈和0.1%甲酸-水溶液作为流动相。考虑到进行农药多残留分析方法的兼容性，选择Waters Atlantis^® T3（2.1 mm×150 mm，3 μm）作为分析柱。

对流动相比例进行考察时发现：采用等度洗脱时，高比例有机相可使目标物很快流出，但不利于待测物与杂质有效分离；低比例有机相会造成峰展宽且分析时间延长、多次进样的重复性差，分析原因认为是某些杂质随时间延长被洗脱后对目标化合物离子化效率产生了影响。梯度洗脱程序可在保证分离效果、优化峰型的同时显著缩短分析时间，改善重复性、降低杂质干扰，故选择使用梯度洗脱程序。

2.4 方法性能

2.4.1 线性范围和定量限

取乙基多杀菌素标准溶液，用乙腈稀释配制成0.2 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L的标准系列，在优化的色谱条件和质谱条件下进行测定，以峰面积为纵坐标，与其对应的浓度为横坐标绘制校准曲线，标准曲线及相关系数如表5所示，定量限（S/N=10）为0.005 mg/kg，能够满足定量要求。

2.4.2 回收率和精密度 

本研究通过在空白基质中加标方法测定回收率来验证方法的正确度。根据食品农产品中有最大允许残留限量（MRL）的样品种类，在代表性样品基质分别选择定量限（LOQ）、最大允许残留量（MRL）和2倍最大允许残留量（2倍MRL）3个水平进行回收率试验，每个水平重复进行6次平行单独测定，得到的添加回收率及方法的相对标准偏差如表6所示。数据表明，方法的回收率范围为81.9%～104.5%，方法的相对标准偏差为4.2%～7.1%，能够满足日常检测需要。空白及加标样品的典型MRM质谱图如图1～13所示。

表5  标准系列的测量范围和线性

Table 5  Measurement range and linearity of standard series

表6  乙基多杀菌素在不同基质中的添加回收率和精密度

Table 6  Recoveries  precisions of spinetoram in different types of matrixes

图1 溶剂空白MRM质谱图

Fig.1  MRM chromatograms of the solvent blank

图2  甜橙空白样品MRM质谱图

Fig.2  MRM chromatograms of the blank sample of sweet orange

图3  甜橙加标样品（0.005 mg/kg）MRM质谱图

Fig.3  MRM chromatograms of spiked sample of sweet orange (0.005 mg/kg)

图4  板栗空白样品MRM质谱图

Fig.4  MRM chromatograms of the blank sample of chestnut

图5  板栗加标样品（0.005 mg/kg）MRM质谱图

Fig.5  MRM chromatograms of spiked sample of chestnut (0.005 mg/kg)

图6  叶用莴苣空白样品MRM谱图

Fig.6  MRM chromatograms of the blank sample of lettuce

图7  叶用莴苣加标样品（0.005 mg/kg）MRM质谱图

Fig.7  MRM chromatograms of spiked sample of lettuce (0.005 mg/kg)

图8  番茄空白样品MRM质谱图

Fig.8  MRM chromatograms of the blank sample of tomato

图9  番茄加标样品（0.005 mg/kg）MRM质谱图

Fig.9  MRM chromatograms of the spiked sample of tomato (0.005 mg/kg)

图10  鲜牛奶空白样品MRM质谱图

Fig.10  MRM chromatograms of the blank sample of milk

图11  鲜牛奶加标样品（0.010 mg/kg）MRM质谱图

Fig.11  MRM chromatograms of the spiked sample of milk (0.010 mg/kg)

图12  猪肉空白样品MRM质谱图

Fig.12  MRM chromatograms of the blank sample of pork

图13  猪肉加标样品（0.010 mg/kg）MRM质谱图

Fig.13  MRM chromatograms of the spiked sample of pork (0.010 mg/kg)

3  结论

本研究针对食品安全国家标准对不同种类食品中乙基多杀菌素残留量的限量要求，通过使用基质分散固相萃取技术，优化建立了多种动物及植物源性食品基质中乙基多杀菌素残留量的液相色谱-串联质谱检测方法。该方法使用乙腈提取食品中的乙基多杀菌素残留，按需进行复水、脱脂等处理后，使用PSA+C₁₈作为净化剂进行分散固相净化；经液相色谱-串联质谱检测，在方法定量限（LOQ）至最大允许残留限量（MRL）范围内回收率高、精密度好、定量准确，操作流程快速简便、灵敏高效，能够满足不同种类食品中乙基多杀菌素残留量检测的需要。

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第一作者：王宇（1985&—），男，汉族，山东青岛人，硕士，工程师，主要从事食品农产品安全检测研究，E-mail：wangyu8511@126.com

1.青岛海关技术中心  青岛  266002

1. Technology Center of Qingdao Customs ,Qingdao  266002

参考文献

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（文章类别：CPST-A）