温尔英¹ 郑耿东¹ 陈文婉¹ 霍伟峰¹ 张会军¹ 周广彪^1*

摘 要 本研究基于霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌的保守基因序列，设计引物并建立相应弧菌的RPA三重检测方法，测试方法的特异性和灵敏度，再进行应用效果测试。结果显示，建立的RPA三重检测方法能够检出三种对应的特异性目标基因片段，仅需恒温37℃反应30 min，不需要特殊的仪器设备，灵敏度可达到10^-1 ng/μl，应用检测结果也表明该方法与传统培养方法相当。综上所述，本研究建立的三重RPA检测方法可同时检测霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌，具有特异性强、灵敏度高，无需特殊的仪器设备，适合实验室快速检测等显著技术和应用优势。

关键词 重组酶聚合酶扩增；拟态弧菌；创伤弧菌；霍乱弧菌；实验室检测

 Establishment of the Detection Method of Marine Vibrio Triple Recombinant Polymerase Amplification (RPA)

WEN Er-Ying¹  ZHENG Geng-Dong¹  CHEN Wen-Wan¹

HUO Wei-Feng¹  ZHANG Hui-Jun¹  ZHOU Guang-Biao^1*

Abstract Based on conserved genetic sequence of Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus and Vibrio cholerae, specific primers were designed and triple RPA detection methods were also developed for each of corresponding vibrio to test their specificity, sensitivity and application effect. The result showed that RPA triple detection method could detect three corresponding specific target gene fragments, at the constant temperature of 37℃ for 30 mins without using other special equipment. And its sensitivity reached 10^-1 ng/μl DNA, which was equivalent to that of the traditional culture method. In brief, the triple RPA detection methods established in this study can simultaneously detect Vibrio mimicus, Vibrio vulnificus and Vibrio cholerae, and have significant technical and application advantages including strong specificity and high sensitivity, no special equipment required, and fitting rapid laboratory detection.

Keywords RPA; Vibrio mimicus; Vibrio vulnificus; Vibrio cholera; Laboratory detection

霍乱弧菌（Vibrio cholerae，VC）、拟态弧菌（Vibrio Mimicus，VM）和创伤弧菌(Vibrio vulnificus，VV)是海水养殖及加工产品中常见的致病性弧菌，也一直是食用海产品导致食物中毒的主要元凶^[1-3]，一旦感染不仅给水产养殖业带来巨大的经济损失，还可严重危害人类健康。因此研究霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌的快速检测方法，对民生社稷及公共安全均具有重大意义。

目前，传统的培养鉴定方法仍是上述三种弧菌的标准检测手段，但该方法不可避免地存在耗时长、操作繁琐等技术缺陷，且具有检测目标单一和灵敏度低等应用局限性。为满足致病菌快速检测的要求，技术人员开发了酶免疫法(EIA)、试纸条法（胶体金、API 生化鉴定等）试纸条、PCR及实时PCR法、环介导恒温扩增(LAMP)等快速高效的检测方法。其中，实时PCR是当今主流分子检测方法，在致病菌检测中的应用也日趋广泛，但该方法也存在检测设备昂贵、产物片段偏小、引物探针设计及检测条件要求较高等问题，致使其无法在基层实验室推广应用。

重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase polymerase amplifcation，RPA）是新兴的恒温核酸扩增技术之一，它在单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶的复合作用下，先将模板DNA解链，进而把引物与匹配模板形成复合体，再延伸生成新的配对链，如此循环往复以指数增长方式达到检测阈值。该方法恒温37℃即可扩增，普通琼脂糖凝胶电泳就能查看检测结果，具有设备依赖低、反应时间短、引物设计简、结果识别易、后续研究广等显著技术和应用优势。

目前国内尚无利用复合重组酶聚合酶扩增技术同时检测霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌的报道，本课题组根据编码霍乱弧菌外膜蛋白（Outer membrane protein，ompW）基因、编码拟态弧菌不耐热溶血素（Vibrio mimicus heat-labile hemolysin， vmhA）基因和编码创伤弧菌DNA促旋酶B亚基单位蛋白（Gyrase subunit B，gryB）基因，设计三组独立的RPA引物，建立对应三种弧菌的RPA三重检测方法，通过测试特异性、灵敏度等应用技术指标，建立能够同时快速检测霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌的即时检测方法，旨在解决部分现场检测中的应用难题。

表1  所用菌株、试剂和主要仪器设备

Table 1  Standard strains, reagents and main instruments used

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器设备

标准菌株、关键试剂及主要仪器设备见表1，再利用本机构以往检测的60份留样进行应用检测。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取

先将参试样本参考国标GB4789增菌和鉴定，按照提取试剂盒说明书提取核DNA，再使用核酸蛋白分析仪（紫外分光光度计）测定并稀释为100 ng/μL检测液。

1.2.2 引物设计

参考等温扩增技术要求，根据对应基因的保守核苷酸序列，分别使用Oligo V6.22软件和Primer Blast工具来完成引物设计及特异性验证，最终设计并交由生工生物工程（上海）技术有限公司来合成的三对引物信息见表2。

1.2.3 RPA 检测方法建立 

以前述制备的三种目标菌株DNA混合液为模板，利用上述引物的不同组合进行RPA扩增测试，并设置无核酸纯水为阴性对照，测试等温37℃下30 min、40 min时的RPA三重扩增检测三种弧菌的不同效果。

按照说明书推荐参数完成RPA扩增体系的配制和扩增，反应结束后，使用酚氯仿离心法去取蛋白沉淀，取4 μL上清液置于1.5%琼脂糖凝胶梳孔中，使用1×TBE、5V/cm恒压电泳50 min进行电泳分离，然后在Tanon-1600凝胶成像仪上观察，并记录实验结果。

1.2.4 RPA三重检测方法特异性评价 

按照1.2.3中优化好的条件进行RPA三重扩增检测，通过测试霍乱弧菌、拟态弧菌、创伤弧菌的7种不同组合，以及剩余8种其他菌株的DNA混合液，进行特异性评价。

1.2.5 RPA三重检测方法灵敏度评价 

将三种标准菌株的检测液混合，再进行5个稀释度、10倍基数的倍比稀释，按照优化好的RPA检测反应体系进行灵敏度测试。

1.2.6 RPA 三重检测方法应用效果评价

选取本机构以往检测过的冻对虾仁等60份阳性样品，包括8份霍乱弧菌、2份拟态弧菌、4份创伤弧菌，1份霍乱弧菌和拟态弧菌双阳性检出。参考对应的国家标准进行样品处理和培养增菌后，使用前述细菌基因组DNA提取试剂盒提取核酸，再用建立的三重RPA方法进行扩增检验，以结果是否与传统鉴定一致来评价方法有效性。另外，分别添加浓度为10⁶～10⁰ cfu/g的拟态弧菌、霍乱弧菌和创伤弧菌标准菌株各1 mL到25 g鱼糜中，培养8 h后用RPA三重扩增方法进行检测，用以模拟测试实际样本中的多弧菌感染时的应用检测效果。

表2  检测拟态弧菌、创伤弧菌和霍乱弧菌引物

Table 2  Primers detected from Vibrio Mimicus, Vibrio vulnificus and Vibrio cholerae

2  结果

2.1 RPA三重检测方法的构建及其特异性评价

以超纯水为阴性对照，采用前述方法对三种弧菌任意组合、其他8种标准菌株进行RPA三重扩增检测，在30 min时便可达到较为理想的扩增效果，可分别检测到234bp的创伤弧菌gryB基因、280bp的霍乱弧菌ompW基因、467bp的拟态弧菌vmhA基因（图1），三种目标基因的任意组合均被成功检出，阴性对照和其他非目标菌株组合均无非特异性扩增。

 N：阳性对照，M：Marker DL 500，1：拟态+霍乱+创伤，2：霍乱+创伤，3：拟态+霍乱，4：拟态+创伤，5：霍乱，6：创伤，7：拟态，8：其他8种弧菌

图1  RPA技术复合检测三种弧菌的结果

Fig.1  Results of Triple RPA detection of three vibrio

2.2 RPA三重检测方法的灵敏度情况

RPA三重检测方法的灵敏度，检测结果如图2：当DNA用量为10^-1 ng时，可以检测到符合预期且明亮清晰的234bp、280bp和467bp的产物带；而当DNA用量为10^-2 ng时，不能检测到前述产物带，提示RPA三重检测方法的灵敏度可达到弧菌基因组核酸的下限为10^-1  ng。

 M: Marker DL 500，1-5: 目标基因组核酸用量依次为102ng、101ng、100ng、10 -1 ng、10 -2 ng

图2  三重RPA检测的灵敏度

Fig.2  Sensitivity test results of Triple RPA method

2.3 RPA三重检测方法的应用效果

应用建立的三重RPA检测方法，对前述阳性留样进行了复检，结果显示8份霍乱弧菌、2份拟态弧菌、4份创伤弧菌及1份霍乱弧菌和拟态弧菌双阳性样本，均检出对应大小的扩增产物，该结果与传统鉴定完全一致，应用效果也符合预期。模拟复杂污染样本的检测结果表明，当目标菌含量在101 cfu/g以上时均可稳定检出，提示该三重RPA的检测方法同样适用于多感染弧菌的应用检测。

3  讨论

RPA技术是时兴的等温扩增技术，但目前尚未见霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌的三重扩增检测报道^[4-10]。本研究建立了针对前述三种常见弧菌的RPA三重检测方法，并测试了方法的特异性、灵敏度和应用测试情况。结果显示，10^-1 ng的基因组核酸、101 cfu/g的目标菌，均可被稳定检出，建立的三重RPA检测方法具有反应时间短、设备依赖低等应用优势，为霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌的疫情监控、污染监测等提供了又一简便高效的解决途径。

课题组之前在研究RPA扩增检测时，发现使用单一RPA引物组只检测一个目标基因时，40 min的扩增效果明显优于30 min^[11-14]，该发现与本研究的三重RPA扩增检测并不一致。三重RPA扩增在30 min时即可达到满意结果，延长至40 min并不能显著增加产物量。综合分析，推测可能与多对引物间的互相干扰有关，6条引物的混合不可避免地形成更为复杂的二级结构，从而影响了RPA扩增的效率，故即便延长时间，扩增效果的改善也不明显。

4  结语

本研究利用重组酶聚合酶扩增技术（RPA）技术，建立了一种能同时检测霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌的等温扩增方法，仅需恒温37℃反应30 min时间，便可完成含有10^-1 ng的基因组核酸或101 cfu/g目标菌的快速检测。该方法具有特异性强、灵敏度高，无需特殊的仪器设备，适合实验室快速检测等技术和应用优势，为水产养殖过程中的疫情监控、水产加工过程中的污染监测提供了一个可靠、简便和高效的快速检测途径。

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基金项目：汕头市科技计划项目（汕府科[2017] 166号-38），广州市科技计划项目（201704030096）

第一作者：温尔英(1984&—)，女，助理工程师，本科，主要从事水产病害检测研究，E-mail：542190210@qq.com

*通讯作者：周广彪（1979&—），男，高级工程师，硕士，主要从事动植物检疫、食品转基因和物种源性成分领域研究，E-mail：312480317@qq.com

1.汕头海关技术中心  汕头  515031

1. Shantou Customs District Technology Center, Shantou  515031

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 （文章类别：CPST-B）