宗 凯¹ 盛 旋¹ 尤征合¹ 吕侠影¹ 孙娟娟¹ 李云飞¹ 张 萍¹ 余晓峰^1*

摘 要 本试验从一批药品中分离到11株疑似芽孢杆菌菌株，采用VITEK 2 systems compact 生化鉴定系统和16S rDNA基因测序技术对其进行鉴定。结果显示，除2株株菌（6号菌株鉴定为Microbacterium oleivorans，8号菌株鉴定为Moraxella osloensis），其他9株株菌均属于芽孢杆菌属（Bacillus）。但仅通过VITEK 2 systems compact鉴定和16S rDNA测序比对，均不能鉴定到种。因此，进一步选择gyrB基因以及其blast分析结果构建系统发育树，最终将1～5号菌株分别鉴定为B. oceanisediminis（99.08%），B. korlensis（90.71%），B. licheniformis（100%），B. marisflavi（97.26%），B. oceanisediminis（99.22%），9～12号菌株分别鉴定为B. megaterium（99.83%），B. boroniphilus（81.20%），B. jeotgali（90.70%），B. humi（81.39%）。实验表明，利用16S rDNA与gyrB基因结合的方式能较好地将芽孢杆菌属鉴定到种，是一种快速准确的芽孢杆菌种间鉴定方法，适合于药品中分离菌株的种属及近缘种的鉴定与区分。  

关键词 芽孢杆菌；16S rDNA；gyrB基因；鉴定

 Identification of Related Species of Bacillus by gyrB Genes

ZONG Kai¹  SHENG Xuan¹  YOU Zheng-He¹  LV Xia-Ying¹

SUN Juan-Juan¹  LI Yun-Fei¹  ZHANG Ping¹  YU Xiao-Feng^1* 

Abstract Eleven suspected Bacillus strains isolated from a batch of drugs were identified by VITEK 2 systems compact biochemical identification and 16S rDNA gene sequencing. The results showed that except for two strains (strain 6 was identified as Microbacterium oleivorans and strain 8 as Moraxella osloensis), the other 9 strains belonged to bacillus. However, the species could not be identified only by VITEK 2 systems compact identification and 16S rDNA sequencing. The phylogenetic tree was constructed by further selection of gyrB gene and its blast analysis results. Finally, strains 1 to 5 were identified as B. oceanisediminis (99.08%), B. korlensis (90.71%), B. licheniformis (100%), B. marisflavi (97.26%), B. oceanisediminis (99.22%), respectively, and strains 9 to 12 were identified as B. megaterium (99.83%), B boroniphilus (81.20%), B. jeotgali (90.70%) and B. humi (81.39%) respectively. The results showed that 16S rDNA combined with gyrB gene was a rapid and accurate method for species identification of Bacillus, suitable for the identification and differentiation of strains and their relatives.

Keywords Bacillus; 16S rDNA; gyrB gene; identification

通讯作者：余晓峰（1967&—），男，汉族，安徽合肥人，硕士，高级工程师，主要从事微生物分离和鉴定，E-mail: 1225987091@qq.com

1.合肥海关技术中心  合肥  230022

1. Technical Center of Hefei Customs, Hefei  230022

芽孢杆菌属（Bacillus）是一类产芽孢的广泛分布在自然界中具有抗逆能力的细菌，多数为革兰氏阳性菌株，好氧或兼性厌氧^[1-2]。在《伯杰氏系统细菌学手册》第二版中列述了芽孢杆菌22个属，包含212种芽孢杆菌，因此，芽孢杆菌属是拥有庞大家族种的细菌。目前，大部分芽孢杆菌是根据《伯杰氏系统细菌学手册》测定菌种的基本特征和测定16S rDNA基因序列来鉴定的。虽然16S rDNA 序列作为一种重要的分子鉴定手段被广泛应用于细菌鉴定中，但是由于种间16S rDNA序列同源性太高，常常不能将分离到的芽孢杆菌鉴定到种^[3-4]。本研究在一批药品的微生物限度检查中发现有疑似芽孢杆菌检出，经营养琼脂培养基分离、纯化得到单菌落，结合生化鉴定系统和16S rDNA测序进行鉴定难以确定其分类地位，随后根据16S rDNA测序和blast比对结果选择gyrB基因进行鉴定，通过构建系统发育树可以对其进一步分类和鉴定。

1  材料与方法

1.1 材料与试剂

营养琼脂培养基（北京陆桥生物有限公司）；PCR mix预混液（上海近岸蛋白科技有限公司）；PCR引物由合肥通用生物科技有限公司合成。

1.2 仪器与设备

VITEK 2 Systems compact（法国生物梅里埃公司）；PCR仪（美国ABI公司）；DNA/RNA全自动电泳系统（德国凯杰公司）。

1.3 从药品中分离疑似芽孢杆菌及纯化

挑取样品中的典型菌落，划线于营养琼脂培养基；于30℃～35℃培养18 h～24 h，均培养至出现单菌落为止。

1.4 VITEK 2 Systems compact生化鉴定

选用VITEK 2 Systems compact微生物全自动分析系统配套的鉴定卡及试剂，使用的鉴定卡包括革兰氏阴性细菌鉴定卡GN（货号21341）、革兰氏阳性细菌鉴定卡GP（货号21342）和芽孢杆菌鉴定卡（货号21345）。VITEK 2 Systems compact鉴定可信度打分高于85%的为可信鉴定结果，低于85%的不采信。

1.5 基因测序与系统发育树构建

提取菌落DNA基因组：从培养基上挑取单个菌落于1.5 mL EP管，65℃孵育1 h后采用磁珠法提取菌落DNA。

表1  扩增用引物

Table 1  Primers for PCR amplification

16S rDNA及gyrB基因扩增条件：预变性95℃ 5 min；变性94℃ 1 min，退火（16S rDNA基因退火条件60℃ l min；gyrB基因退火条件55℃ 30 s），延伸72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。待电泳有目的带后，送测序公司测序。

测序结果采用blast比对与分析，未能鉴定到种的菌株进一步采用gyrB基因等进行扩增测序与鉴定，具体引物序列如表1所示。

采用MEGA7.0软件邻位相连法(Neighbor-joining, NJ)构建系统发育树，选择最大复合似然法(Maximum composite likelihood, MCL)构建模型，使用1000次重复检测的Bootstrap值表示树上各节点的支持率。

2  结果与分析

2.1 生化特征鉴定结果

VITEK 2 systems compact全自动生化鉴定仪鉴定结果如表2所示。1～5号菌株鉴定结果与数据库匹配可信度不到90%；9号和11号菌株鉴定结果与数据库匹配可信度分别为95%和97%；10号菌株和12号菌株鉴定结果打分低于85%，结果不采信，即未能鉴定出结果。

2.2 基于16S rDNA基因鉴定并构建系统发育树

将16S rDNA测序序列进行blast比对分析，1号菌株得到Query coverage 99%和Max ident 99%的结果100个，其中，B.firmus 33个，B.oceanisediminis 31个，B.subtilis 1个，其余只能显示到属B.sp.。

2号菌株得到Query coverage 100%和Max ident 96%以上的结果49个，其中，B.korlensis 5个，B.beringensis 6个，其余只能显示到属B.sp.或显示Uncultured bacterium。

3号菌株得到Query coverage 100%和Max ident 100%的结果63个，B.aerius 2个，B.licheniformis 29个，B.tequilensis 1个，B.haynesii 13个，B.paralicheniformis 10个，其余只能显示到属B.sp.。

4号菌株得到Query coverage 100%和Max ident 99%的结果100个，其中，B. aquimaris 15个，B.marisflavi 31个，其余只能显示到属B.sp.。

5号菌株得到Query coverage 99%和Max ident 99%的结果100个，其中，B.oceanisediminis 32个，B.firmus 30个，B.subtilis 1个，其余只能显示到属B.sp.。7号菌株与5号菌株基因序列完全一致，应为同一株菌，因此合并为一株菌分析和进一步鉴定。

6号菌株得到Query coverage 99%和Max ident 99%的结果100个，鉴定到种的仅有Microbacterium oleivorans。

8号菌株得到Query coverage 99%和Max ident 99%的结果100个，Moraxella osloensis 34个，其余未显示种属。

9号菌株得到Query coverage 100%和Max ident 100%的结果100个，B.aryabhattai 27个，B.megaterium 21个，其余只能显示到属B.sp.。  

10号菌株得到Query coverage 100%和Max ident 100%的结果100个，B.subterraneus 35个，B.thioparans 7个，B.boroniphilus 5个，B.cohnii 1个，其余只能显示到属B.sp.。

11号菌株得到Query coverage 100%和Max ident 100%的结果100个，B.boroniphilus 11个， B.haynesii 13个，B.jeotgali 12个，B.paralicheniformis 10个，B.subterraneus 5个，其余只能显示到属B.sp.。

12号菌株得到Query coverage 100%和Max ident 100%的结果100个，B.humi 12个，B.timonensis 15个，B.humi 12个，B.sinesaloumensis  1个，其余只能显示到属B.sp.。

从blast比对结果看，除6号菌株鉴定为Microbacterium oleivorans、8号菌株鉴定为Moraxella osloensis，其他9株菌均为芽孢杆菌属。从NCBI数据库下载37条芽孢杆菌属包含约20个种的16S rDNA基因序列，与1～5号菌株、9～12号菌株构建系统发育树，如图1(A)所示。1号和5号菌株与B.subtilis，B.oceanisediminis，B.firmus有较近的亲缘关系（Bootstrap值为100，Bootstrap值代表归类成簇的可信度，大于70表示可信），完全可以归为一簇。同理，2号菌株与B.korlensis，B.beringensis（Bootstrap值为100），3号菌株与B.haynesii，B. paralivheniformis，B.licheniformis，B.aerius，B.tequilensis（Bootstrap值为100），4号菌株与B.aquimaris，B.marisflavi（Bootstrap值为100），9号菌株与B.aryabhattai，B.megaterium（Bootstrap值为100），10号菌株与B.subterraneus，B.thioparans  B.cohnii，B.boroniphilus（Bootstrap值为100），11号菌株与B.boroniphilus，B.subterraneus，B.jeotgali，B.selenatarsenatis（Bootstrap值为100），12号菌株与B.humi，B.timonensis（Bootstrap值为100），均各成簇。

2.3 基于gyrB基因鉴定并构建系统发育树

设计一对以gyrB基因为靶目标基因的通用引物，扩增片段长度约796 bp，经芽孢杆菌gyrB796-F/芽孢杆菌gyrB796-R扩增，1～5号菌株、9～12号菌株均能扩出目的片段，通过测序与blast比对，1号菌株与B.oceanisediminis相似度99.08%（Query coverage 99%），2号菌株与B.korlensis相似度90.71%（Query coverage 99%），3号菌株与B.licheniformis相似度100%（Query coverage 100%），4号菌株与B.marisflavi相似度97.26%（Query coverage 100%），5号菌株与B.oceanisediminis相似度99.22%，9号菌株与B.megaterium相似度99.83%（Query coverage 100%），11号菌株与B.jeotgali相似度90.70%（Query coverage 100%），10号菌株、12号菌株测序序列经blast比对未得到相似度大于90%的结果，10号菌株与B.boroniphilus相似度81.20%，12号菌株与B.humi相似度81.39%。      

表2  11株菌株生理生化、16S rDNA测序及结合gyrB基因鉴定结果

Table 2  Identification results of VITEK 2 analysis, sequencing of 16S rDNA and gyrB genes of 11 B. strains

注：/表示未能鉴定出结果；-表示未进行鉴定，其中，6号和8号菌株已采用16S rDNA鉴定到种，无需进一步鉴定。

从NCBI中下载25条芽孢杆菌属gyrB基因序列，结合1～5号菌株、9～12号菌株gyrB基因扩增产物测序序列构建了系统发育树，如图1(B)。基于gyrB基因序列blast结果构建的菌株系统发育树，可以将1号菌株、5号菌株鉴定为B.oceanisediminis，2号菌株鉴定为B.korlensis，3号菌株鉴定为B.licheniformis，4号菌株鉴定为B.marisflavi；9号菌株与B.megaterium，B.aryabhattai，10号菌株与B.boroniphilus，11号菌株与B.boroniphilus，12号菌株与B.humi，B.timonensis亲缘关系较近。

3  结论

从药品中分离到的菌株首先采用VITEK 2 systems compact全自动生化鉴定仪进行鉴定，鉴定可信度打分以85％作为临界值点，1～5号菌株、9号菌株、11号菌株鉴定可信度打分超过85%，10号菌株、12号菌株鉴定结果低于85%，不予采信。总体而言，1～5号菌株鉴定可信度打分在85%，处于临界值，与16S rDNA基因序列鉴定结果相比，可信度打分均低于16S rDNA基因序列鉴定。VITEK 2 systems compact全自动生化鉴定仪鉴定结果与16S rDNA基因序列鉴定结果一致的仅有3号菌株和9号菌株。采用VITEK 2 systems compact全自动生化鉴定仪因数据库受限，对菌株鉴定总体可信度得分不高，因此，采用VITEK 2 systems compact全自动生化鉴定仪很难将样品中分离的芽孢杆菌菌株鉴定到种。

(A )                                           （B）

图1  基于16S rDNA基因（A）和gyrB基因（B）序列blast结果构建的菌株的系统发育树

Fig.1  Phylogenetic tree of Bacillus strain based on blast results of 16S rDNA and gyrB sequence

根据16S rDNA基因序列分析，初步鉴定自药品中分离的11株菌株中，9株经鉴定为芽孢杆菌属，另外2株分别是Microbacterium oleivorans菌、Moraxella osloensis菌。但由于16S rDNA基因难以区分亲缘关系接近的菌种，如1号菌株采用16S rDNA 测序比对有B.subtilis，B.oceanisediminis，B.firmus等3个种100%匹配，9株菌至少有2个种与之100%匹配，难以鉴定到种。为进一步鉴定芽孢杆菌属9株菌，引入了gryB基因^[5-6]。

gyrB基因是普遍存在于细菌中编码促旋酶B亚单位的基因，该基因序列长度约1.2 kb～1.4 kb，很多文献研究表明该基因序列在区分和鉴定细菌近缘种方面比16S rDNA基因更有优势。文献[7]通过对枯草芽孢杆菌类的gyrB基因序列、16S rDNA基因序列比较分析，结果表明8种近缘枯草芽孢杆菌的16S rDNA序列的相似性在98.1%～99.8%之间，难以区分；而gyrB基因的相似性则在75.4%～95.0%之间，结果表明gyrB基因是在种水平上区分枯草芽孢杆菌近缘种的有效靶标基因。文献[8]采用16S rDNA基因序列比较分析，18株H血清型蜡状芽孢杆菌间的相似率均在99%以上，16S rDNA基因不能区分各菌株，而基于gyrB基因序列的系统发育树明显将其分为4组，这也表明与16SrDNA相比，gyrB基因在蜡状芽孢杆菌近缘种具有更高的差异性。

本课题实验经16S rDNA鉴定为芽孢杆菌属的9株菌，由gyrB基因进一步鉴定，1号菌株与B.oceanisediminis相似度99.08%（Query coverage 99%），2号菌株与B.korlensis相似度90.71%（Query coverage 99%），3号菌株与B.licheniformis相似度100%（Query coverage 100%），4号菌株与B.marisflavi相似度97.26%（Query coverage 100%），5号菌株与B.oceanisediminis相似度99.22%，9号菌株与B.megaterium相似度99.83%（Query coverage 100%），11号菌株与B.jeotgali相似度90.70%（Query coverage 100%），10号菌株、12号菌株测序序列经blast比对未得到相似度大于90%的结果；除10号菌株、12号菌株未能被鉴定，1～5号、9号、11号共7株株菌基本得到鉴定，除11号菌株相似度为90.70%，其他菌株相似度均在97%以上。

综上所述，将未知芽孢杆菌菌株鉴定到属，采用生化鉴定或16S rDNA基因鉴定都可以，但要做种间鉴定需要利用16S rDNA结合特异性基因信息进行，比如16S rDNA和gyrB基因结合进行blast比对和系统发育树分析，可以快速、准确地将目标菌株鉴定到种。

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参考文献

[1]喻国辉, 牛春艳, 陈远凤, 等. 利用16S rDNA结合gyrA和gyrB基因对生防芽孢杆菌R31的快速鉴定[J]. 中国生物防治学报, 2010, 26(002): 160-166.

[2]严婉荣, 肖敏, 陈圆, 等. 芽孢杆菌基本特征, 16SrRNA对比分析及特异性基因挖掘[J]. 基因组学与应用生物学, 2017, 036(011): 4686-4692.

[3]安然, 易图永, 肖启明, 等. gyrB基因在细菌分类和检测中的应用[J]. 江西农业学报, 2010, 22(004): 18-20. 

[4]郝云婕, 韩素贞. gyrB基因在细菌系统发育分析中的应用[J]. 生物技术通报, 2008, (002): 39-41.

[5]李献梅, 王小芬, 杨洪岩, 等. 促旋酶(gyrase) B亚单位基因gyrB在鉴别细菌近缘种中的应用[J]. 微生物学报, 2008, 48(5): 701-706.

[6]申应德, 张新, 李杰, 等. 药品中非脱羧莱克勒菌的分离与鉴定[J]. 药学研究, 2013(10): 566-568.

[7] Wang L T, Lee F L, Tai C J, et al. Comparison of gyrB gene sequences, 16S rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in the Bacillus subtilis group[J]. International Journal of Systematic  Evolutionary Microbiology, 2007, 57(8): 1846-1850.  

[8] La Duc MT, Satomi M, Agata N, et al. gyrB as a phylogenetic discriminator for memhers of the Bacillus anthracis-cereus-thuringiensis group[J]. Journal of Microbiological Methods, 2004, 56(3): 383-394.

（文章类别：CPST-A）