兰 丰¹

摘 要 建立了超高液相色谱-大气压化学电离串联质谱（UPLC-APCI-MS/MS）测定水果中复硝酚钠残留量的分析方法，研究了复硝酚钠在水果中的膳食摄入风险。样品经乙腈匀浆提取，氨基固相萃取柱净化，质谱检测，外标法定量。运用慢性风险商（%ADI）和急性风险商（%ARfD）对水果中复硝酚钠的急（慢）性膳食摄入风险进行估计。结果显示：冬枣、樱桃、葡萄和蓝莓检出复硝酚钠残留，残留量为0.01～5.42 mg/kg，冬枣中复硝酚钠的检出率最高（94.7%）。风险评估结果表明：冬枣中复硝酚钠对儿童存在不可接受的急性和慢性膳食摄入风险，对一般人群的风险可接受。葡萄、樱桃、蓝莓中复硝酚钠对两类人群的风险均可接受。建议相关部门加强冬枣生产中复硝酚钠的管控。

关键词 复硝酚钠；水果；残留；风险评估；超高液相色谱-大气压化学电离串联质谱

Residues Analysis and Risk Assessment of Sodium Nitrophenolate in Fruits

LAN Feng¹

Abstract A method was developed for the quantitative determination of sodium nitrophenolate in fruits by ultra performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-triple quadrupole mass spectrometry(UPLC-APCI-MS/MS). Chronic risk quotient (%ADI) and acute risk quotient (%ARfD) were used to evaluate the acute and chronic dietary intake risks of sodium nitrophenolate in fruits. Samples were extracted by acetonitrile, purified by amino solid phase extraction column, detected by mass spectrometry, and quantified by external standard method. The monitoring results showed that the sodium nitrophenolate was detected in jujube, cherry, grape and blueberry, and the residual levels ranged from 0.01 mg/kg to 5.42 mg/kg. The detection rate of sodium nitrophenolate in jujube was 94.7%. The risk assessment results show that sodium nitrophenolate in jujube has unacceptable acute and chronic dietary intake risks for children, while the risks to the general population are acceptable. The risks of sodium nitrophenolate in grapes, cherries and blueberries to both populations are acceptable. It is suggested that relevant government departments strengthen the control over the use of sodium nitrophenolate in jujube production.

Keywords sodium nitrophenolate; fruits; residues; risk assessment; ultra performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-APCI-MS/MS)

基金项目：国家果品质量安全风险评估（GJFP2019011）；山东省农业科学院农业科技创新工程：山东省主要农产品质量安全风险评估与控制技术研究（CXGC2016B17）

作者简介：兰丰（1986&—），男，山东乳山人，博士，农产品质量安全与风险评估，E-mail：lanfeng9527@163.com

1. 农业农村部果品及苗木质量监督检验测试中心  烟台 265500

1. Quality Supervision  Testing Center of Fruits and Nursery Stocks, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yantai  265500

复硝酚钠是农业生产中应用十分广泛的一类植物生长调节剂，最早由日本旭化学工业株式会社研发。在粮食作物和经济作物上能提高产量，改善品质。与肥料或农药混施能增强肥效和药效。在畜牧业和渔业上，作为饲料添加剂能提高肉、蛋产量。具有低成本、高效益的特点^[1,2]。

虽然复硝酚钠在农业生产中增产作用很突出，但如果不正确、不合理使用，往往会引起人们对其安全性的担忧。欧盟从2007年开始评估农产品中复硝酚钠的风险，发现复硝酚钠能迅速被人体吸收，并广泛分布于各器官，引起人体高铁血红蛋白血症，对眼睛有刺激和严重伤害风险。2015年欧盟对所有农产品制定了统一的限量标准0.03 mg/kg，相对较严^[3]。而美国环保部也早已将邻硝基苯酚和对硝基苯酚列为“优先控制污染物”^[4]。中国首先于2002年将邻硝基苯酚和对硝基苯酚列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》，随后在2008年又将其列入“动物性食品中不得检出的药物”^[5]。但直到2016年才首次规定植物源农产品小麦、大豆、番茄、马铃薯和柑橘5种作物中复硝酚钠最大残留临时限量^[6]。考虑到食品安全和健康风险，水果中复硝酚钠残留至少应低于最大残留限量标准。但截至目前，我国最新版食品安全国家标准（GB 2763-2019）中仅制定了柑、橘、橙中复硝酚钠最大残留临时限量（0.1 mg/kg），其余水果尚未制定^[7]。

复硝酚钠含有三种化学成分：5-硝基邻甲氧基苯酚钠（Na 5-NG）、邻硝基苯酚钠（Na o-NP）和对硝基苯酚钠（Na p-NP）。其中，Na o-NP硝基上的氧原子与邻位酚羟基上的氢原子形成了分子内氢键，使得酚羟基中的氢原子不容易电离。在电喷雾（ESI）离子源下测定Na o-NP灵敏度很低，比同分异构体的Na p-NP灵敏度低3个数量级，实际检测过程中往往被忽视或遗漏。大气压化学电离（APCI）与电喷雾电离的原理不同，主要用于弱极性和小分子化合物的分析。国内外很多研究者成功运用APCI源测定了ESI源下电离差的化合物，取得了较好的结果^[8,9]。

开展农产品质量安全风险评估是国际通行做法，有助于明确农产品农药残留与风险状况，确定需重点关注的高风险因子和高风险人群，制（修）订农药最大残留限量和进出口贸易措施^[10,11]。本文利用超高液相色谱-大气压化学电离串联质谱仪（UPLC-APCI-MS/MS）建立了水果中复硝酚钠残留快速测定方法，评估我国主产区苹果、梨、葡萄等大宗果品和枣、樱桃等小宗果品中复硝酚钠膳食风险，旨在摸清我国主要果品中复硝酚钠残留状况和风险水平，为制定水果中复硝酚钠最大残留限量和进出口贸易措施提供科学支撑。

1  实验部分

1.1 仪器与试剂

LC-MS 8040 液相色谱-串联质谱仪（日本岛津公司）；IKA T25 高速匀浆机（德国IKA公司）；SK-1 快速混匀器（常州国华电器有限公司）；Milli-Q超纯水系统（德国默克集团）；N-EVAP氮吹仪（美国Organomation公司）；氨基固相萃取小柱500mg/6 mL（美国Agilent公司）。

乙酸铵（优级纯）购于天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇（质谱级）、乙腈（色谱纯）和邻硝基苯酚钠（纯度≥99%）、对硝基苯酚钠（纯度≥99%）、5-硝基邻甲氧基苯酚钠（纯度≥98%）均购于上海安谱实验科技股份有限公司，其他均为国产分析纯试剂。

1.2 溶液的配制

复硝酚钠标准工作溶液：将邻硝基苯酚钠、对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠标准品用甲醇逐级稀释，配制成5个浓度的复硝酚钠标准工作溶液（1.0、0.5、0.1、0.05和0.01 mg/L）。

复硝酚钠基质匹配标准溶液：用苹果、葡萄和枣空白样品，经提取、净化、浓缩、定容后得到的基质溶液，分别将邻硝基苯酚钠、对硝基苯酚钠和5-硝基邻甲氧基苯酚钠标准品配制成0.01、0.05、0.1、0.5和1.0 mg/L的复硝酚钠基质匹配标准溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 前处理方法

提取：称取20.0 g破壁后的试样，加入20.0 mL乙腈，匀浆提取2 min，滤纸过滤，滤液收集到装有5.0～7.0 g氯化钠的100 mL具塞量筒中，盖上塞子，剧烈震荡1 min，静置分层；取2.0 mL上清液于50℃水浴下氮吹至近干，用2.0 mL V（二氯甲烷）：V（甲醇）=95:5 溶解，待净化。

净化：将待净化液加入经4 mL V（二氯甲烷）：V（甲醇）=95:5淋洗活化后的氨基固相萃取柱，待液面到达萃取柱筛板后，用6 mL V（二氯甲烷）：V（甲醇）=95:5分两次洗脱，收集洗脱液于50 ℃水浴氮吹至近干，加入甲醇定容至2 mL，过0.22 μm尼龙滤膜，待测。

1.3.2 仪器分析

色谱柱：Shim-pack XR-ODS色谱柱（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）；柱温 40℃；进样量 1μL；流动相A：2 mmol/L 醋酸铵，流动相B：甲醇；流速为0.4 mL/min。梯度洗脱程序：0～1.0 min，10%B；1.0～4.0 min，10%B～50%B；4.0～6.0min，50%B～95%B；6.0～8.0min，95%B；8.0～8.1 min，95%B～5%B。对硝基苯酚钠、5-硝基邻甲氧基苯酚钠和邻硝基苯酚钠出峰时间分别在5.0 min、5.7 min和5.4 min左右。

质谱条件：APCI负电离模式；多反应监测（MRM）模式；接口温度 350 ℃；脱溶剂管温度：200 ℃；加热模块温度200 ℃；雾化气流速 3.0 L/min；干燥气流速 5.0 L/min。

1.3.3 方法验证

通过特异性、线性、检出限（LOD）、定量限（LOQ）、基质效应和回收率对方法进行验证评价。在相同检测条件下，用空白样品在目标化合物保留时间附近是否存在干扰来评价方法的特异性，通过测定0.01-1.0 mg/L的浓度范围内标准工作溶液和基质匹配标准溶液来评价方法的线性，以两种曲线的斜率评价基质效应。检出限和定量限分别通过3倍信噪比和最低加标水平确定。通过加标回收计算回收率和相对标准偏差评价方法的准确性和精密度。

1.4 膳食风险评估

1.4.1 数据来源

根据种植面积和影响力，2015年～2019年连续5年从主要果品产区采集样品1718批次，其中葡萄415批次、苹果310批次、樱桃245批次、梨205批次、冬枣190批次、蓝莓120批次、桃118批次、西瓜115批次。样品广泛分布于山东、江苏、湖北、陕西、河北、辽宁、吉林和新疆8个省（自治区）。

1.4.2 慢性膳食摄入风险评估

慢性膳食摄入风险采用公式（1）进行评判^[12]。式中：STMR表示规范试验残留中值，取平均残留量^[13]，单位mg/kg；F表示不同人群日均水果摄入量^[14]，单位kg；ADI表示每日允许摄入量，单位mg/kg；bw表示体重，单位kg。当%ADI≤100%时表示风险可接受，当%ADI＞100%时，表示风险不可接受。

     （1）

1.4.3 急性膳食摄入风险评估

急性膳食摄入风险采用公式（2）进行评判^[12]。式中：U表示单果重；HR为最高残留量，取97.5百分位点值^[14]，单位mg/kg；LP表示大份餐（Large portion）^[15]，单位kg；v表示变异因子（variability factor）；bw表示体重，单位kg；ARfD表示急性参考剂量，单位mg/kg。

   （2）

2 结果与分析

2.1 质谱条件优化

通过单针进样，正/负离子全扫描，确定了3种化合物前体离子峰均为[M-H]。在大气压化学电离负模式下，打碎前体离子（母离子），进行子离子扫描，找到2个响应值较强的子离子作为定量离子和定性离子。以确定的母离子和子离子，自动优化Q1电压、碰撞能和Q3电压。优化结果见表1。复硝酚钠的3种化合物MRM色谱图见图1。

2.2 净化方式的确定

QuChERS前处理采用分散固相净化，虽然简便快速，但常存在基质效应，主要用于样品初筛^[16]。此外，还需要根据样品种类配制不同的基质匹配标准溶液来消除基质效应，该过程繁琐，效率不高。氨基固相萃取柱的净化效果要优于QuChERS前处理，在许多标准中推荐使用，因此在复硝酚钠的前处理净化过程中首选氨基固相萃取柱。通过优化选择，确定了洗脱溶剂为V（二氯甲烷）∶V（甲醇）=95∶5，洗脱体积为8 mL（2 mL+3 mL+3 mL），分3次洗脱。在此条件下净化效果好，三种目标化合物的回收率也能满足检测要求。

表1  复硝酚钠的相关质谱参数

Table 1  MS parameters of the sodium nitrophenolate

图1  复硝酚钠的MRM色谱图（0.05 mg/L）

Fig.1  MRM chromatograms of the sodium nitrophenolate (0.05mg/L)

2.3 基质效应和线性范围

采用M_E=B/A评价基质效应，其中：A为纯溶剂配制标准溶液曲线斜率，B为基质匹配标准溶液曲线斜率。当M_E比值在0.8～1.2之间表明基质效应不显著^[17]。从表2可知：复硝酚钠在苹果、葡萄、冬枣中的M_E为0.95～1.0，基质效应不显著，可以忽略。

在0.01～1.0 mg/L浓度范围内，三种化合物的峰面积与进样浓度之间呈良好线性关系。R²≥0.999（见表2）。

2.4 方法的考察

向空白的苹果、葡萄和冬枣样品添加不同水平浓度的目标化合物，通过添加回收试验考察方法的准确度和精密度。结果（表3）表明：在0.01～1.0 mg/kg添加水平下，3种化合物在3种水果中平均回收率为89%～104%，精密度为3.2%～11%，可以满足农药残留分析的要求。通过3倍信噪比，得到Na o-NP和Na p-NP检出限均为0.005 mg/kg，Na 5-NG检出限为0.002 mg/kg。根据添加回收试验，确定三种化合物在水果中定量限均为0.01 mg/kg。

表2  复硝酚钠的线性范围和基质效应

Table 2  Linear ranges and matrix effects of sodium nitrophenolate

表3  复硝酚钠在3种基质中的添加回收率和相对标准偏差（RSD）

Table 3  Recoveries and RSDs of sodium nitrophenolate in different substrates

表4  复硝酚钠残留量检出情况

Table 4  Residue levels of sodium nitrophenolate in fruits

2.5 膳食风险评估

2.5.1 复硝酚钠在水果的残留分布

检出复硝酚钠残留的水果为冬枣、樱桃、蓝莓和葡萄，检出率分别为94.7%、89.8%、85.0%和63.9%。苹果、梨、桃、西瓜均未检出。监测结果表明：枣中复硝酚钠残留量范围为0.056～5.42 mg/kg，樱桃为0.017～0.56 mg/kg，蓝莓为0.01～0.15 mg/kg，葡萄为0.01～0.48 mg/kg，详见表4。

2.5.2 复硝酚钠的慢性膳食摄入风险

对冬枣、葡萄、樱桃和蓝莓4种水果的复硝酚钠进行慢性膳食摄入风险评估。选择儿童和成人两类人群进行考察，结果详见表5。4种水果的复硝酚钠慢性膳食摄入风险值为5%～146%，风险从高到低分别为冬枣、葡萄、樱桃和蓝莓。冬枣中复硝酚钠对儿童的慢性膳食摄入风险为146%，超过100%，可能会给儿童造成不可接受的风险；对成人的慢性膳食摄入风险为82.4%，小于100%，风险可以接受。其余3种水果的复硝酚钠对成人和儿童的慢性摄入风险在5.0%～24.6%之间，均小于100%，风险较低。

2.5.3 复硝酚钠的急性膳食暴露风险

考察了冬枣、樱桃、葡萄和蓝莓中复硝酚钠对儿童和成人两类人群的急性膳食摄入风险。结果显示：4种水果的复硝酚钠急性膳食摄入风险值为2.0%～172.4%，风险从高到低依次为冬枣、葡萄、樱桃和蓝莓。其中，冬枣中的复硝酚钠对儿童的急性膳食摄入风险为172.4%，大于100%，可能会对儿童造成不可接受的急性膳食风险，而对成人的风险为56.9%，小于100%，风险较低。其余3种水果中的复硝酚钠对儿童和成人的急性膳食摄入风险值在2.0%～95.0%之间，小于100%，风险在可接受范围之内。

表5  4种水果中复硝酚钠对两类人群的慢性膳食摄入风险

Table 5  Chronic dietary intake risk of sodium nitrophenolate in four kinds of fruits to two types of population

表6  4种水果中复硝酚钠对两类人群的急性膳食摄入风险

Table 6  Acute dietary intake risk of sodium nitrophenolate in four kinds of fruits to two types of population

3  讨论与结论

全面的膳食风险评估不仅要考虑到不同性别、特殊人群（包括孕妇、婴儿、老人）等因素，还需要大量的基础膳食数据作支撑^[18]。本研究仅对儿童和一般人群在消费水果时复硝酚钠的暴露风险进行了初步评估，为相关研究者提供参考。而要进一步明确各人群的复硝酚钠全膳食摄入风险，需要扩大对各类食物中复硝酚钠残留水平的监测，开展不同农产品中复硝酚钠残留和消解规范性试验，掌握各类人群膳食数据，这也是今后研究的重点。本文在评估冬枣等4种水果的复硝酚钠慢性膳食摄入风险时，每类水果的日均摄入量按日均水果总摄入量计算，虽然遵循了风险高估原则，但每类水果的日均摄入量要低于水果总摄入量，慢性膳食摄入风险可能会降低。

为解决复硝酚钠中邻硝基苯酚钠在电喷雾离子源下电离度差，灵敏度不高的问题，建立了水果中复硝酚钠快速、准确分析的UPLC-APCI-MS/MS法，该方法的准确度和可靠度符合农残检测要求。利用该方法对全国8个果品主产区的冬枣等8种水果（共1718批次）开展了复硝酚钠风险监测。结果显示：8种果品中冬枣、樱桃、葡萄和蓝莓检出复硝酚钠残留，残留量范围为0.01～5.42 mg/kg，检出率最高为冬枣（94.7%），其余4种水果未检出复硝酚钠。急（慢）性膳食风险评估结果表明：冬枣中复硝酚钠对儿童存在不可接受的急性和慢性膳食摄入风险，对一般人群的风险可接受。葡萄、樱桃、蓝莓中的复硝酚钠对两类人群的风险均可接受。鉴于冬枣中复硝酚钠的高检出率、高残留量和高风险性，建议相关部门加强对冬枣中复硝酚钠的风险预警和管控，同时对复硝酚钠在各类人群的全膳食摄入风险进行风险评估深入研究。

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（文章类别：CPST-C）