王 晶¹ 于卓然² 张鑫鑫¹ 高媛惠¹ 王 静¹ 岐少莹¹ 

摘 要 本文建立了梨和黄瓜中多抗霉素的高效液相色谱质谱检测方法。用甲醇-水（7+3）溶液旋涡混合提取试样中多抗霉素，改进QuEChERS法净化，使用ACQUITY UPLC BEH Amide以0.1%甲酸/乙腈溶液进行梯度洗脱，采用电喷雾电离方式（ESI+），通过多反应监测（MRM）定量。结果表明，在2μg/L～50μg/L浓度范围内，多抗霉素B的线性关系良好，相关系数r均达到0.99，回收率在63%～98%之间，相对标准偏差（RSD）均小于10%。该方法快速、简便、精确度高、准确度高，对梨和黄瓜中多抗霉素的检测有普遍适用性，其他蔬菜和水果也可参考使用。

关键词 QuEChERS；梨；黄瓜；多抗霉素；高效液相色谱-串联质谱

 Determination of Polyoxin Residues in Pear and Cucumber

 by High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry with Modified QuEChERS

WANG Jing¹  YU Zhuo-Ran²  ZHANG Xin-Xin¹  GAO Yuan-Hui¹  WANG Jing¹  QI Shao-Ying¹

Abstract A method of the detection of polyoxin in pears and cucumbers by high performance liquid chromatography with mass spectrometry was developed. Samples ware extracted by vortex mixing with methanol-water (7+3) solution, purified with QuEChERS, applied gradient elution by ACQUITY UPLC BEH Amide with a mixture of 0.1% formic acid and acetonitrile, and finally quantified by ESI+ and MRM. The results showed that the linear relationship was good in the concentration range of 2 μg/L to 50 μg/L , and the correlation rate was more than 0.99. The average recoveries ranged from 63.0% to 98.0% with relative standard deviation less than 10%. The method is rapid, simple, sensitive and accurate. It has universal applicability to determination of polyoxin residues in pears and cucumbers and can serve as a reference for the detection of polyoxin residues in other vegetables and fruits.

Keywords QuEChERS; pear; cucumber; polyoxin; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

多抗霉素是由日本理化学研究所铃木三郎博士等人于1963年从熊本县阿苏郡坊中的土壤中分离出的一种放线菌，是优秀的生物杀菌剂^[1] ，由日本科研制药株式会社独家生产，商品名为“宝丽安”，一直是日本主要的上市农药品种之一。

多抗霉素（polyoxin）具有独特的作用机制，可选择性地抑制真菌细胞壁的组成成分几丁质的合成，能使芽管及菌丝体局部膨大、破裂，细胞内含物泄出，导致死亡。此外，还能抑制孢子的产生和病斑的扩大，是一种具有广谱性的抗生素类杀菌剂^[2]。多抗霉素的有效成分为多抗霉素B，主要对小麦白粉病、水稻纹枯病、黄瓜霜霉病、瓜类枯萎病、人参黑斑病、苹果早期落叶病、林木枯梢病、甜菜褐斑病及梨黑斑病等多种真菌性病害具有良好的防治效果^[3-4]。多抗霉素因其低毒、高效、广谱性成为目前使用最广泛、开发最成功的一种农用抗生素。但随着多抗霉素在农业生产中的大量使用，由其引起的环境和食品安全问题日益突出，因此，研究多抗霉素在水果蔬菜中残留量的检测方法具有重要意义^[5-6]。

目前，国内外对多抗霉素的研究集中在病虫害防治方面，而在残留限量方面的研究不多。我国GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》中对部分水果和蔬菜制定了临时限量，其他国家仅日本对部分农作物多抗霉素制定限量，详见表1，因此，在检测过程中无可参考的检测标准和文献，已有文献报道的关于多抗霉素的分析有生物效价、毛细管电泳法，这些方法均操作繁琐^[7] 、耗时长、准确度低、精密度差，目前我国尚无多抗霉素的检测标准^[8] 。本文建立的改进QuEChERS结合UPLC-MS/MS法测定了梨和黄瓜中多抗霉素的残留量，与生物测定法、高效液相色谱法等相比，具有灵敏度高、干扰小、分析速度快等优点，可为产品质量控制及相关分析测试工作提供技术支持。

1  材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：多抗霉素B（德国DR公司）；甲醇（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；十八烷基硅烷键合硅胶（C18）：40 μm～60 μm；石墨化炭黑（GCB）：40 μm～120 μm；双圈定性滤纸；水为Milli-Q纯水仪制备。

表1  多抗霉素限量要求

Table 1  Residue limits of polyoxin

1.2 仪器与设备

QTRAP 4500超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国AB SCIEX公司）；DTA-33型超声波清洗机（湖北鼎泰生化科技设备制造有限公司）；MS3型涡旋混合器（德国IKA公司）；HC-3518型高速离心机（合肥市科大创新股份有限公司中佳分公司）。

1.3 标准溶液

1.3.1 标准储备液

准确称取10 mg（精确至0.1 mg）多抗霉素B于10 mL容量瓶中，加5 mL超纯水溶解后，用甲醇定容至刻度，配成1000 mg/L的标准储备液，于4℃下避光保存。

1.3.2 标准工作溶液

准确移取标准储备溶液（1.3.1）1.0 mL于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇-水（7+3）溶液定容至刻度，浓度为10.0 mg/L，于4℃下避光保存。

1.3.3 基质标准工作溶液

取不同体积的标准工作溶液（按1.3.2所述方法制备），用空白样品提取液配成适合浓度的基质标准工作溶液，现用现配。

1.4 实验方法

1.4.1 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide，1.7 μm，2.1 mm×30 mm；柱温40℃；进样量10 μL；

流动相：A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液，流速及梯度洗脱条件见表2。

表2  流动相流速及梯度洗脱条件

Table 2  Mobile phase velocity and gradient elution conditions

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测（MRM）；

电喷雾电压：5500 V；

离子源温度：550℃；

雾化气压力：65 psi；

气帘气压力：25 psi；

辅助加热气：60 psi。

定量离子对、定性离子对、去簇电压及碰撞能量见表3。

表3  主要参考质谱参数

Table3  Mainly refersence to mass spectrum parameters

注：*为定量离子。

1.4.3 样品前处理

1.4.3.1 样品提取

称取约5 g试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入15 mL甲醇-水（7+3）溶液，涡旋混匀，超声提取20 min；6000 r/min离心5 min，取上清液滤纸过滤，收集全部滤液用甲醇-水（7+3）溶液定容至20 mL，待净化。

1.4.3.2 样品净化

取上述溶液2 mL，加入十八烷基硅烷键合硅胶（C18）50 mg、石墨化炭黑（GCB）10 mg，涡流混合1 min，过0.22 μm有机系滤膜过滤，待测。

2  结果与分析

2.1 样品前处理方法的选择

QuEChERS是近年来在农产品检测中广泛使用的一种快速样品前处理技术，其步骤可简单归纳为：使用单一溶剂乙腈对粉碎样品进行提取分离，加入MgSO₄等除水，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）等吸附剂除杂，最后上清液过膜进行检测。本试验对传统的QuEChERS方法进行了改进优化，依据多抗霉素的性质选用甲醇-水溶液作为提取溶剂，同时考察了不同的吸附剂对目标物的吸附能力，最后选用C18粉和石墨化炭黑（GCB）作为净化剂。

2.1.1 提取溶剂的选择 

多抗霉素B易溶于水，微溶于甲醇、丙酮等有机溶剂，在酸性和中性溶液中稳定，在碱性溶液中不稳定。试验分别考察了甲醇-水，0.1%甲酸水对多抗霉素的提取效果，0.1%甲酸水会提取出来较多的糖类和色素，干扰较大；比较甲醇-水（50+50，体积比）与甲醇-水（70+30，体积比）的提取情况，甲醇-水（70+30，体积比）提取的杂质少，回收率高，因此，选用甲醇-水（70+30，体积比）作为提取剂。

2.1.2 净化方法的选择

QuEChERS方法中常用的吸附剂主要有乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、C18粉及石墨化炭黑（GCB）等^[9-10]。试验考察了黄瓜和梨2种基质提取液中分别加入PSA、C18粉和GCB的净化效果，PSA作为吸附剂时，多抗霉素B 的回收率大大降低（见表4及图1），因此，试验选择C18粉和GCB作为吸附剂。

表4  不同吸附剂的吸附效果

Table 4  Adsorption effect of different adsorbents 

2.2 色谱柱的选择

农药检测液相色谱分离常用的色谱柱多为C18、C8、氨基柱、苯基柱等，由于多抗霉素分子极性强，易溶于水，不溶于有机试剂，在普通的反相色谱柱上没有保留，因此，选择了BEH HILIC、BEH T3、BEH Amid用于分离极性物质的色谱柱。结果表明，多抗霉素B在BEH Amid色谱柱上获得了良好的保留，如图2所示。

图1  净化方式比较

Fig.1  Comparison of purification methods

图2  多抗霉素B色谱图

Fig.2  Polyoxin B chromatogram

2.3 流动相的选择

液相色谱多采用甲醇和乙腈作为流动相，试验中乙腈是比甲醇更弱的洗脱溶剂，有利于多抗霉素B在色谱柱上的保留。此外，根据多抗霉素B在酸性和中性条件下稳定的性质，比较乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液体系中目标物的峰形和分离度，最终选择乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

2.4 线性关系及检出限

准确吸取多抗霉素B标准溶液适量，用空白基质溶液稀释为2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L系列标准溶液，在上述分析条件下进行测定，以定量离子的峰面积对多抗霉素B质量浓度进行线性回归。在2 μg/L～50 μg/L浓度范围内，以梨为基质检测的回归方程：y = 4079.42923 x ，相关系数为0.99976；以黄瓜为基质检测的回归方程：y = 3534.33737 x ,相关系数为0.99985。按10倍信噪比得出多抗霉素B在梨和黄瓜中定量限为10 μg/kg，按3倍信噪比得出检出限为5 μg/kg。

2.5 回收率和精密度

以梨、黄瓜为基质，分别添加5 μg/kg、10 μg/kg、50 μg/kg 3个浓度水平的多抗霉素B标准溶液，每个浓度水平设置6个重复和空白对照，按上述条件测定并计算回收率及精密度。结果表明（见表5），多抗霉素B的平均添加的回收率在63%～98%之间，相对标准偏差（RSD）均小于10.0%。

3  样品检测

按照试验建立的方法对出口监控送检的15批次梨样品进行多抗霉素B普查，15份样品均小于检出限，详见表6。

表5  梨和黄瓜中多抗霉素B的加标回收率和相对标准偏差

Table 5  Standard recovery and relative standard deviation  of polyoxin B in pear and cucumber

表6  15批鲜梨多抗霉素B的检测结果

Table6  Detection results of polymyxin B in 15 batches of fresh pears

4  结论

本文建立了梨和黄瓜中多抗霉素的高效液相色谱质谱检测方法。用甲醇-水提取试样中多抗霉素，改进QuEChERS法净化，液质联用仪采用电喷雾电离方式（ESI+），通过多反应监测（MRM）定量。该检测方法简便快捷，灵敏度、精密度和准确度较高，可应用于日常多抗霉素B的残留检测。同时，该方法检测周期短、检测成本低，可扩展适用于各类水果和蔬菜基质中的多抗霉素B残留检测（使用前做方法验证，使用中做质控），为各检测机构对多抗霉素B残留检测提供了参考依据。

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参考文献

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 （文章类别：CPST-B）