李云飞¹ 王 英¹ 陶 蕾¹

摘 要 本研究选自云南昌源2017年、2018年、2019年的普洱茶作为样本，采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术，对不同年份普洱茶的主要化学成分进行了研究分析，发现不同年份普洱茶的化学成分在含量上具有较大差异。采用主成分分析（Principal component analysis，PCA），可以对来自不同年份的普洱茶进行有效区分，结合组学分析（Compound  Discoverer，CD）软件筛选出在不同年份普洱茶中含量具有显著差异的5个标志物并对其进行了结构鉴定，采用Origin软件进行差别分析，建立了最大化地凸显不同组别之间的差异模型。试验结果表明，模型通过对已知样本的预判测试，显示出所建立模型能很好地区分三组不同年份的普洱茶。

关键词 普洱茶；超高效液相色谱（UHPLC）-高分辨质谱联用技术；年份鉴别；主成分分析；判别分析

 A Study on Identification Method of Pu-erh Tea Year Based on High Resolution Mass Spectrometry

LI Yun-Fei¹  WANG Ying¹  TAO Lei¹

Abstract The main chemical components of the Pu-erh tea from Changyuan County of Yunnan Province in 2017, 2018 and 2019 were analyzed by ultra performance liquid chromatography (UHPLC) -high resolution mass spectrometry (HRMS). The chemical components of the Pu-erh tea from different years are significantly different. Pu-erh tea from different years (2017, 2018 and 2019) could be separated by principal component analysis (PCA). Five markers with significant difference in content Pu-erh tea of different years were screened out and their structures were identified by Compound Discoverer (CD) software. The anticipation model of different groups was established by discriminant analysis of the Origin software. The results show that the model can be used to distinguish three groups of Pu-erh tea of different years.

Keywords Pu-erh tea; UHPLC-HRMS; identification of years; principal component analysis(PCA); discriminant analysis

中国是茶树的原产地，茶叶在中国有着悠久的饮用历史，如今已经成为风靡全球的三大天然饮料之一。云南作为茶树原产地中心，因其独特的自然条件，拥有丰富的古树茶资源，再加上其极具民族特色的制茶文化，从而孕育了普洱茶这一云南特有的地理标志保护产品。普洱茶是一种茶性温和的茶，能够促进肠胃蠕动，防止人体细胞氧化，在预防冠心病、降血压、防衰老、助消化、减肥降脂以及抗癌等方面都有一定的功效，在中国深受消费者的喜爱。普洱茶所具有的独特品质特征是在存放过程中后发酵形成的，其中的主要化学成分^[1-3]茶多酚、生物碱、芳香化合物等物质的含量和比例在存放中都会发生变化,从而使得汤色、香味都会有所不同，并趋向最佳状态，因此很多消费者喜欢购买年份久远的茶叶。然而，近年来一些不法商家在利益的驱使下，对茶叶年份进行造假，利用一些不法手段，如在高温高湿存储条件下加速新茶的发酵，使其快速呈现出老茶的外形特征；更有一些不法商家用具有强氧化性的化学药剂浸泡新茶，让新茶快速氧化“变老”“变旧”，这样经处理的“老茶”不但不具有“老茶”本身的独特品质，还会给消费者身体健康带来伤害，因此普洱茶年份真假的鉴别越来越受到了消费者的关注。

目前对于普洱茶的年份鉴别和评审主要依靠理化分析和感官鉴别^[4-6]，该方法简单快捷，但对人员要求较高，且较为主观，这种方法很容易受外界因素的干扰。也有研究采用GC-MS、红外光谱^[7-9]开展不同年份普洱茶中化合物差异的分析，但这两种方法对茶叶中的化合物鉴别都有局限性，例如GC-MS法仅对茶叶中的挥发性有机物有响应，能够提供的化合物信息较少，不利于茶叶样本的差异分析。本文所采用的超高效液相色谱-高分辨质谱对茶叶中大多数化合物有响应，并且能通过采集到的质谱信息对化合物进行结构鉴定，有助于分析不同年份普洱茶中化合物的差异。

本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱技术，结合组学分析软件Compound  Discoverer（CD）对不同年份的普洱茶进行了组学研究，筛选出有效的标志物并对其进行鉴定。通过主要成分分析、差别分析、多元统计分析建立了一种快速、准确、客观的鉴别普洱茶年份的新方法。

1  实验部分

1.1 仪器、试剂、材料

超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱联用Q-Exactive（美国ThemoFisher Scientific公司）；高速冷冻离心机 (德国Sigma公司) 、Milli-Q高纯水发生器（美国Millipore公司）；分析天平（0.01mg，瑞士Mettler公司）；超声波清洗器(SB-5200D)；

乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），甲酸（色谱纯），实验用水均为高纯水（Milli-Q高纯水发生器纯化）、甲酸铵（优级纯）。

本实验选取沧源不同年份的普洱茶品，包含33个不同来源的样本。具体样品信息如表 1所示。

表1  茶叶样品信息表

Table 1  Sampling information of Pu-erh tea

1.2 样品前处理方法

准确称取茶叶样品0.5 g加入10 mL甲醇-水（50∶50）提取液，涡旋混匀两分钟；4000 rpm离心5 min，取上层清液，过膜，待上机测定。

1.3 仪器条件

色谱柱：Accucore C18 AQ (100mm×2.1mm,2.6μm)，柱温为30℃ ；进样体积10μL；流速0.3 mL/min。流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；采用梯度洗脱程序：0～2 min，95% A和5% B； 2～42 min, 5% A和95% B；42～47 min，5%A和95%B；47.1～50 min，95%A和5%B；

质谱条件：可加热的电喷雾离子源（H-ESI）；正负切换扫描模式；Full MS-ddMS2扫描模式，扫描范围50～000 m/z；Full MS分辨率 70000（FWHM） at m/z 200，ddMS2分辨率17500(FWHM) ) at m/z 200；喷雾电压为2800 V;鞘气（N₂）流速35bar；辅助气（N₂）流速10 bar；离子传输管温度350℃。

2  结果和讨论

2.1 柱子选择

为保证茶叶样品中尽可能多的成分能够有效地被测定，本实验对不同型号的色谱柱进行了考察，包括：Accucore C18 AQ、Hilic、Accucore RP-MS。实验结果表明， Accucore C18 AQ 色谱柱在正负离子模式下能够对茶叶样品中的化合物进行较好地分离和有较高的响应，见图1。

2.2 流动相的选择

本研究分别考察了水-甲醇、水-乙腈、0.1%甲酸水-乙腈作为流动相的效果，结果表明：水-甲醇作为流动相峰型较差，响应较低；水-乙腈作为流动相峰型好，响应较低；0.1%甲酸水-乙腈作为流动相能得到较好的峰型，较多成分并且响应值高，最终本研究采用0.1%甲酸水-乙腈作为流动相。

2.3 数据的重现性

本研究在进样序列中穿插了质量控制样品（QC），对系统的稳定性进行了考察。在整个进样周期（72小时）内，某一个化合物的保留时间（RT）偏差 ＜5s，其响应值（NL）RSD 为＜ 25% ，质量精度偏差在 5ppm 以内。实验结果表明，系统有良好的稳定性、重现性和质量精度。

2.4 统计学分析 

图1  Accucore C18 AQ色谱柱的总离子色谱图（TIC）

Fig.1  Total ion chromatogram of Accucore C18 AQ column

采用 CD 软件对采集到的茶叶样本中的化学组分进行提取、过滤（P-Value ＜ 0.05），及统计学分析。不同年份茶叶得到化合物共3163个。根据化合物的精确质量数，同位素分布及二级碎片离子等信息，采用MASSCLOUD软件、ChemSpider 网络数据库对化合物进行了鉴定和确证后，共筛选到85种化合物。这些化合物主要为茶叶中几类物质：茶多酚、生物碱、蛋白质和氨基酸类、茶色素、芳香类物质。茶多酚是茶叶中的主要成分，主要包括儿茶素、黄酮及黄酮醇类、花白素及花青素类等，儿茶素是茶多酚中最重要的一种，约占茶多酚含量的60%到80%^[10]，它是一组具有抗氧化活性的物质，在后期发酵过程中，因儿茶素氧化途径和氧化程度不同，对茶的色、香、味品质等都会有影响，因此这类物质是我们考察年份茶叶差异性重点关注的一类化学物质。生物碱是一类含氮有机化合物,在茶叶中生物碱含量可达2%~5%^[11]，主要是嘌呤类生物碱，本研究在三组茶叶样本中主要筛查到了咖啡碱、可可碱等几种嘌呤碱。咖啡碱是茶叶重要的滋味物质，是影响茶叶质量的一个重要因素，也是形成茶汤滋味的重要成分，其与茶黄素以氢键缔合后形成的复合物具有鲜爽味。芳香类化合物虽然不是人体必需的营养元素，但却是形成茶香的重要组成成分，茶叶香气受到茶叶品种、生长地理位置及加工工艺的影响，特别在后发酵过程中，因储存条件、储存年限不同，使得茶叶中的各种芳香化合物在组成和比例上发生变化，从而形成了茶叶独特的香型。本研究基于上述筛选出的85种化合物，采用CD软件对其进行了主成分分析（PCA），不同年份普洱茶主成分分析得分图见图2。主成分分析法^[12]（ principal components analysis，PCA） 是一种通过数据降维来排除化学信息的重叠性和相关性的多元线性统计分析方法，通过统计得到的得分图能够体现数据内在的规律性，表征样本间的距离与相似程度，距离远近代表茶样组之间的差异大小。图2表明，在这3个分析组中不同年份的普洱茶能较好地分开，聚类趋势明显，无明显离群组分。2017年与2019年茶样在主成分得分图上相距最远，代表着两组样本的化学成分差异大，而2017年与2018年、2018年与2019年相距较近，差异相对较小，这也符合普洱茶后发酵规律，茶叶中的化合物会随着年限长短其含量发生变化，年份越接近，相应的差异化越小。

图2  三组不同年份茶叶样品的主成分分析（PCA）图

Fig.2  Principal component analysis (PCA) of three groups of tea samples in different years

在主要化合物中找出三组化合物响应峰面积 （ratio） 差异明显，且在 TIC图中有明确色谱峰的化合物，作为潜在标志物。选取的5个标志物在三组茶叶（2017，2018，2019）中的相对含量如图3所示。从图3中可以看到，在这5种差异明显的标志物中，杨梅黄酮和表没食子儿茶素在茶叶中的含量和比例的差异，导致了茶叶滋味的差异。有研究表明^[13]，茶汤中酯型儿茶素与非酯型儿茶素的含量和比例是影响茶汤苦涩味的重要因素，酯型儿茶素含量和比例较高的茶汤苦涩味及收敛性较强，而非酯型儿茶素含量和比例较高的茶汤苦涩味及收敛性较弱，且回味爽口。另外，本研究中鉴定到的差异相对明显的芳香醛类物质4-羟基苯甲醛、3,4-二羟基苯甲醛，从图3中看到3,4-二羟基苯甲醛在三个年份中含量差异较之4-羟基苯甲醛更为明显，其在2018年茶样中的含量最高，2019年次之，2017年含量最低，从趋势来看并不是逐年递增，这也表明普洱茶在后发酵过程中不同芳香化合物之间可能会存在相互转换，导致其比例和含量在不同年份样本中都有所不同，从而构成不同年份的普洱茶所具有的独特茶香。

表2  茶叶中五种标志物鉴定结果

Table 2  The identification results of five markers in tea

图3  五种生物标志物在三组普洱茶（2017、2018、2019）中的相对含量

Fig.3  Relative content of five biomarkers in three groups of Pu-erh tea (2017, 2018, 2019)

2.4 建模与预判

将33批茶叶样品随机分为2组：建模组和验证组。其中样品 2017-10、2017-11、2018-10、2018-11、2019-10、2019-12为验证组，其余样品为建模组。以选取的5个生物标志物为指标，用建模组样品建立模型，并用验证组样品进行判别分析（图4），判别结果如表4所示。从表4中可看出，6份样品品种判别结果均正确。

3  结论

本研究采用超高效液相色谱-高分辨质谱联用法对来自不同年份的33个茶叶样本进行了成分分析，根据其获得的精确质量数，同位素分布及二级碎片离子等信息，结合CD软件快速鉴定到了85个化合物，运用聚类分析与主成分分析方法对数据进行处理，实现了不同年份茶叶的清晰区分。实验找出样本中化合物响应差别显著的五个潜在标志物，采用Origin软件进行差别分析，建立了最大化凸显不同组别之间的差异模型，通过对已知样本的预判测试，结果表明，所建立模型能很好地区分三组不同年份的普洱茶。该研究结果也为其他种类茶叶的年份鉴别提供了参考。

表3  验证组样品判别结果

Table 3  Sample discrimination results of test groups

图4  三组茶叶（2017，2018，2019）的判别分析图

Fig.4  Discriminant analysis of three groups of tea (2017,2018,2019)

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（文章类别：CPST-C）