李国伟¹ 邹 鲁² 谢少冬³ 杨 亮³ 丁 斌⁴ 湛 嘉^4* 曹国洲⁴ 陈先锋⁴

摘 要 本文建立了饲料中24种极性-中等极性β-受体激动剂类药物的可靠灵敏的检测方法。采用含乙腈-甲酸铵组合沉淀剂和正己烷双相提取净化，下层通过2%甲酸水溶液稀释后，经过混合阳离子交换固相萃取小柱（MCX）进一步净化。通过耐100%水相的反相C₁₈色谱柱保留，UPLC-MS/MS电喷雾正离子模式下分析。结果表明，优化后的前处理方法能充分去除复杂基质的干扰，特异性好，灵敏度高。定量检测限范围在0.1～1 μg/kg之间。基质添加曲线定量的线性良好，在猪饲料中3个添加水平的平均回收率范围在82.2%～124.8%之间。添加回收重复性和日间精密度范围分别为0.8%~14.9%和2.2%～14.6%，均低于20%，符合欧盟2002/657/EC相关规定。

关键词 饲料；β-受体激动剂；混合阳离子交换固相萃取；高效液相色谱-串联质谱联用

 Combination of Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Analysis of 24 Beta-Adrenergic Receptor Agonists in Animal Feed

LI Guo-Wei¹  ZOU Lu²  XIE Shao-Dong³  YANG Liang³

DING Bin⁴  ZHAN Jia⁴  CAO Guo-Zhou⁴  CHEN Xian-Feng⁴

Abstract A universal, rapid and simple analytical method able to identify 24 beta-adrenergic receptor agonists in animal feed was developed. The feed was extracted and purified by the ammonium formate-acetonitrile precipitator and n-hexane, and then the underlying layer was diluted by 2% formic acid aqueous solution and further purified by the MCX SPE cartridges. A 100% water-resistant reversed phase C₁₈ column was retained and analyzed in UPLC-MS/MS in positive ion mode. The results showed that the optimized pretreatment method could fully remove the interference of complex matrix with good specificity and sensitivity. The limit of quantification (LOQs) varied from 0.1 to 1 μg/kg. The linearity of matrix-matched addition curves were more than 0.9900. Average recovery of the spiked analytes in feed were in the range from 82.2% to 124.8% with associated RSD values from 0.8% to 14.9% under the selected conditions. The inter-day precision was in range of 2.2% to 14.6%, which was acceptable and in agreement with the criteria of Commission Decision 2002/657/EC. 

Keywords animal feed; beta-adrenergic receptor agonists; MCX; Ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

饲料是畜禽的“粮食”,也是人类的间接食品。饲料安全同食品安全一样直接关系人类健康与生存，食品安全监管关口前移至饲料安全已成全社会共识。在众多的饲料危害因子之中，β受体激动剂(以下简称β激动剂)等违禁药品成为了饲料安全关键控制点之一^[1- 2]。β激动剂分为选择性和非选择性两类，其中选择性包括选择性β₁和β₂两个类型。与β₁选择性受体分布在心脏不同，β₂激动剂是一类能够激动分布在气道平滑肌上的受体产生支气管扩张作用的哮喘治疗药物，也是滥用频率最高的类型^[2]。无论是哪个类型的β激动剂进入牲畜体内都能够改变养分的代谢途径，促进动物肌肉生长，尤其是促进骨骼肌蛋白质的合成，加速脂肪的转化和分解，显著提高牲畜的瘦肉率，提高饲料转化率，实现更高经济效益^[1-3]。然而，消费者食用被β激动剂污染的肉类可导致严重的后果，甚至危及生命。一系列大规模的集体中毒事件引起了世界各国的高度重视，许多国家都禁止在食源性动物的生产中使用。我国也于2002年颁布了相应的禁用法规。但时至今日，仍有不法分子铤而走险，监管工作具有长期性^[4]，尤其是低含量添加在基质高度复杂的饲料中非常具有隐蔽性。

为了防止滥用β激动剂类药物，目前已开发了大量关于动物组织、毛发、尿液、饲料中的激动剂的检测方法^[3-14]。然而，对于基质复杂的饲料来说，β激动剂项目覆盖全面的方法且检测限低于1～2 μg/kg的方法较为罕见，有的研究甚至将作用相反的心安得、倍托洛尔、喷布洛尔、利托君、拉贝洛尔等β阻断剂与β激动剂混为一谈。饲料中β激动剂的分析具有高度的复杂性，与动物组织、尿液相比，高度脱水的饲料基质成分要复杂得多，富含蛋白质、碳水化合物、脂肪、纤维素等，同时包含动物源性和植物源性成分，克服基质效益难度大。其次，由于克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺等得到非常重视，检测方法非常成熟，检测试剂盒和试纸条也得到了大量推广使用，不法分子采用其他物质如苯胺A、沙美特罗等不常检的同类物进行非法添加，因而容易被忽视。另外，随着畜禽肉中激动剂的检测低限要求越来越严格，尤其是克罗特罗低至0.05 μg/kg，而针对目前欧盟规定的饲料为50 μg/kg的检测限^[13-14]。我们认为非常有必要降低检测限，以防止饲养动物的长期低剂量摄入而带来超标风险。这无疑对饲料的前处理要求提出更大的挑战。

综上所述，饲料中非法添加β激动剂具有长期性、隐蔽性和检测复杂性，开发饲料中种类覆盖全面、灵敏、可靠的相关物质的检测方法，对保护消费者身体健康、降低合法养殖企业运营风险显得尤为迫切。为此，我们尝试并成功开发了饲料中24种β激动剂的SPE-LC-MS/MS分析方法，以适应新形势需要。

1  实验部分

1.1 化学品和试剂

24种β激动剂标准物质（清单见表1）购自Sigma-Aldrich、Dr. Ehrenstorfer、Witega和EU pharmacopoeia等公司，用甲醇溶解，并配制成0.5 mg/mL。用移液器吸取各单标适量，用甲醇稀释成125 ng/mL的混合标准工作溶液，-18℃冷藏，混合标准工作溶液更新不超过2个月。乙腈和其他流动相涉及的试剂由美国天地公司提供（HPLC级别）。其他试剂均为国产分析纯。乙腈-甲酸铵组合沉淀剂(Supertech AFAP，cat.# 55251-4)购自浙江哈迈科技公司。Oasis MCX小柱（60mg/3cc）购自美国Waters公司。水由Milli-Q纯水仪(Millipore)纯化得到。

1.2 样品

所有饲料样品从网上购买。选取有代表性的100 g样品用厨用粉碎机粉碎，20℃常温避光干燥保存。

1.3 前处理

称取粉碎后的饲料样品2.5 g(精确到0.01 g)于50 mL刻度离心管中，加入20 mL乙腈-甲酸铵组合沉淀剂和正己烷10 mL，以20000转/min匀浆3 min，涡旋混合10 min。在0℃下，以4500 r/min离心10 min，取5 mL下层清液到另一只50 mL离心管中，用2%甲酸溶液稀释至25 mL。在MCX SPE小柱里塞1cm高的脱脂棉，用5 mL甲醇和10 mL2%甲酸水溶液依次活化后，将上述25 mL稀释提取液经过该SPE小柱，流速控制约1 mL/min，然后用2%甲酸、水和甲醇各5 mL依次洗涤小柱，取出脱脂棉，用含有5%氨水的甲醇3 mL洗脱2次，收集洗脱液，在40℃水浴中氮吹至0.2 mL以下，用2%甲酸水溶液定容至1.0 mL刻度线，经0.2 μm尼龙滤膜过滤至2 mL进样瓶中，供LC-MS/MS测定。

1.4 UPLC-MS/MS 分析

分析仪器为Acquity UPLC超高效液相色谱仪联用XEVO TQS三重四级杆质谱仪（美国，waters）；色谱柱为Acquity Waters HSS-T₃ C₁₈（2.1 mm ×100 mm, 1.8 μm）；柱温：45℃；流动相A和B分别为：甲醇（含甲酸0.1% (v/v)）和水（含甲酸0.1% (v/v)）。流速：0.25 mL/min；梯度洗脱条件为(t in min): t 0, A = 0%; t12, A = 80%; t 12.1～15, A = 100%，t 15.1, A = 0%，保持2.5 min；进样量：5 μL；流路切换：0~2.6 min和12～17.6min 切换阀打开，色谱柱流出液进入废液，2.6～12 min期间进行质谱采集。通过多反应监测(MRM) 进行数据采集，正离子模式毛细管电压分别为3.5 kV，离子源和去溶剂气温度分别为150℃和500℃；去溶剂和锥孔流速分别为950 L/h和150 L/h；碰撞氩气为4×10^-3 mba。

1.5 方法验证 

在2.50 g空白样品中分别加入混合标准溶液0、10、50、100、250、500 μL标准溶液，静置15 min后，按上述前处理方法处理后，以浓度为横坐标，响应值为纵坐标，做基质添加标准曲线，作为定量的依据。

为了考察潜在的干扰峰，对15个不同的空白样品进行前处理并分析。以10倍信噪比作为定量检测限。在2.50 g空白样品中，加入混合标准工作液0、0.25、0.5、1、2.5、5 ng，以信号大于10倍基线噪音确定最低定量限。在2.50 g空白样品中加入混合标准溶液50、100和500 μL，按上述前处理方法处理后进行测定，每个水平重复6次，测定3个添加水平的回收率和精密度。连续6天，在2.50 g样品中添加100 μL混合标准工作液，计算批间精密度。

2  结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

2.1.1提取方法的优化

从当前文献报道来看，提取动物源性食品和饲料中β激动剂的常见的溶剂包括三氯乙酸5%^[8]、高氯酸溶液 ^[7, 9]、80%乙腈水溶液^[10]、80%甲醇水溶液（含盐酸）^[11]、乙腈（含1%乙酸）^[12]等。为了获得更好的蛋白沉淀效果和提取效率，我们对比了5%三氯乙酸、5%高氯酸、市售的乙腈-甲酸铵组合沉淀剂、80%甲醇（含有0.1mol/L的盐酸）等4组提取溶剂。结果表明：组合沉淀剂蛋白沉淀效果最佳，溶液完全呈透明澄清状；80%甲醇（含有0.1 mol/L盐酸）的沉淀效果次之；5%三氯乙酸的沉淀效果最差。从提取效率来看，乙腈-甲酸铵组合沉淀剂和80%甲醇（含有0.1 mol/L盐酸）的回收率基本相当。因此我们选择了乙腈-甲酸铵组合沉淀剂。β激动剂的极性范围为极性-中等极性之间，以极性化合物为主的弱碱性化合物。其中，异丙喘宁、塞曼特罗、沙丁胺醇、特布他林水溶性最强，用乙腈、乙酸乙酯等有机溶剂从水溶液中萃取效率极低，而沙美特罗的疏水参数参考值(XlogP)为3.9，几乎不溶于水，可溶于甲醇、氯仿，为典型中等极性属性。因此，若要全面覆盖这类药物范围，采用纯水提取或纯有机溶剂提取均不适合，尤其对于富含蛋白、碳水化合物和脂肪等成分的干物质饲料来说。乙腈-甲酸铵组合沉淀剂由酸性甲酸铵缓冲液、乙腈和乙醇等组成。既含水相和有机相，提取的极性范围相对以往报道的提取液更加宽泛，而且具有良好的沉淀蛋白的净化效果。Courtheyn等（1996）详细比较了33种针对饲料中克伦特罗和沙丁胺醇的提取和净化方法，指出使用水相中添加有机溶剂对净化起到十分关键的作用^[15]，与本方法有类似之处。

2.1.2固相萃取净化的优化

混合阳离子固相萃取柱是提取、净化激动剂最常用也是最有效的手段，这类填料包含反相和阳离子交换两种基团，对于保留在其上的碱性化合物，可以用甲醇或乙腈等有机溶剂淋洗而不降低回收率，因而可获得非常好的净化效果^{[5, 11, 16]}。高有机溶剂含量的提取液直接上MCX SPE小柱虽非常便利，但我们发现，上样液中有机溶剂的强度对多数目标物的保留和基质效益影响非常显著。为此，对上述乙腈-甲酸铵组合沉淀剂和80%盐酸甲醇提取液和它们用2%甲酸溶液稀释5倍后上样的情况进行对比。从图1可以看出，无论是组合沉淀剂（含有60%有机相）还是80%甲醇盐酸溶液直接上样，对斑布特罗、异丙喘宁、沙丁胺醇、特布他林、塞曼特罗和齐帕特罗等的保留明显减弱，且有机相越高，80%甲醇盐酸溶液的保留值降低越明显。通过甲酸稀释降低有机溶剂含量后上样，这些物质的保留得到明显增强，响应增强倍数达到1.9～12.4倍之间。但对于苯胺A、福莫特罗、溴布特罗、沙美特罗等，稀释后上样，反而响应相对变小，这可能是高浓度有机相直接上样，不仅不影响这些物质的保留，而且减弱了饲料基质成分的保留，因而基质效应变小而响应强度增大所致。从MCX小柱保留的颜色深浅和最终进样溶液的颜色深浅，也验证了这一观点。两种提取液稀释后的保留情况比较接近。尽管如此，组合沉淀剂稀释后整体上可获得相对更平衡的回收率，因而最终被选择。

近年来，不少学者将原本用于果蔬中农药残留的QuEChERS 前处理方法应用于饲料中激动剂提取净化^{[10,12, 17-19]}。虽可以省去固相萃取净化的繁琐步骤，并获得较好的重复性，但无法达到混合阳离子SPE小柱的净化效果，其检测限往往很难达到50 μg/kg以下。

 (乙腈-甲酸铵组合沉淀剂提取液用M1（60%有机溶剂含量）表示，其稀释5倍用M2表示（12%有机溶剂含量）；80%盐酸甲醇提取液用M3表示（80%有机溶剂含量），其稀释5倍用M4表示（16%有机溶剂含量）；重复数n=3)

图1  饲料中添加水平5 μg/kg，不同有机溶剂含量上样对β激动剂响应的影响

Fig.1  Effects of different organic solvent content on the response intensity of beta-adrenergic receptor agonists（Spiked at 5 μg/kg, n=3）

图2  在猪饲料中添加5 μg/kg的激动剂的典型MRM图谱（包括，最早、最晚出峰的化合物）

Fig.2  MRM chromatograms of the most representative compounds from different class in the spiked porcine feed

表1  猪饲料中24种激动剂中英文名称标准曲线斜率、回归系数、定量限、三个水平（低、中、高）回收率及其变异系数、日间精密度

Table 1  The retention time, slope linearity, LOQs, range of average recovery, repeatability and inter-day precision of 24 agonists in porcine feed（(n=6)

备注：1-24中文名称依次为异丙喘宁、塞曼特罗、特布他林、沙丁胺醇、齐帕特罗、塞布特罗、非诺特罗、克伦塞罗、克罗丙罗、莱克多巴胺、氯丙那林、克伦特罗、溴代克仑特罗、妥布特罗、溴布特罗、马布特罗、苯氧丙酚胺、克仑潘特、斑布特罗、丙卡特罗、马HE喷特罗、福莫特罗、苯胺A和沙美特罗。

2.2 色谱条件和质谱条件的优化

笔者比较了在流动相分别添加2.5 mmol/L乙酸铵和0.1%甲酸的色谱保留情况。但克伦特罗、苯胺A等出峰较晚的目标峰明显变宽，降低了信噪比，影响其灵敏度。因此，选择0.1%甲酸不仅能改变峰形，而且促进正离子的电离效率，从而获得更高的响应强度。T3色谱柱能耐100%水相，起始流动相从100%水相，并用缓和的梯度洗脱，不仅有利于目标物获得更好的保留和分离度，同样能增加目标物与杂质的分离度，在一定程度上可降低基质效应。

2.3 方法的有效性

2.3.1 选择性、线性和定量检测限

根据15个空白猪饲料样品的分析发现，在受试的24种激动剂目标化合物中，本方法基本能提供低背景的质谱图，没有发现明显的干扰峰，具有满意的选择性，见图2。在线性范围内0.25 ng/mL～25 ng/mL，相关系数R在0.9923～0.9990。定量检测限为0.1μg/kg～1 μg/kg，除异丙喘宁外都能达到0.5 μg/kg或以下，远优于欧盟建议的检测低限50 μg/kg^[13-14]，也优于刘佳等（2015）报道的定量低限10 μg/kg^[11]。因此，本方法能更好地规避因长期摄入低含量的激动剂（尤其是克伦特罗）饲料给畜禽产品带来的风险。详细的线性和定量限见表1。

2.3.2 准确性和重复性

3个水平的平均添加回收率在82.2%~124.8%。添加回收重复性和日间精密度范围分别为0.8%～14.9%和2.2%～14.6%，RSD均低于20%。这些表明了本方法的准确性和重复性基本满足定量要求。详细的回收率、日内和日间精密度数据见表1。

2.4 实际应用

该方法被成功应用于抽检的畜禽饲料50份样品中，阳性样品共计2个，分别含有氯丙那林1.6和2.8 μg/kg，远低于欧盟限量标准50 μg/kg，总体上，本次抽查的饲料安全风险较小。

3  结论

    饲料里24种极性-中等极性的激动剂，通过双相提取净化，阳离子交换SPE小柱净化能有效地去除复杂饲料基质干扰。具有特异性强、灵敏度高，准确性和重复性理想等特点，可满足动物饲料中β激动剂全面筛查与确证的需要。

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