史 敏¹ 刘学辉¹ 徐 晔¹ 唐泰山¹ 柯家法¹

摘 要 采用荷兰皇家热带病研究院WHO钩体病参考中心设计的一对引物进行普通PCR检测。经反应条件与体系优化，对犬钩端螺旋体与霍乱弧菌，伤寒杆菌，沙门氏菌，产毒性大肠杆菌，致病性大肠杆菌, 痢疾, 溶藻菌，非O1、O139霍乱弧菌，副溶血性弧菌，O157菌进行检测，除犬钩端螺旋体以外均为阴性, 表明钩端螺旋体PCR检测方法与以上菌株无交叉反应, 证明了该钩端螺旋体PCR检测方法具有特异性；双链DNA灵敏度检测结果显示PCR方法可以检测到的核酸浓度最低为3×10³拷贝。此结果证明该犬钩端螺旋体PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏度，可用于犬钩端螺旋体样品的检测。

关键词 犬钩端螺旋体；PCR；检测

 Application of PCR Method for Detection of  Ca nine Leptospira  

SHI Min¹  LIU Xue-Hui¹  XU Ye¹  TANG Tai-Shan¹  KE Jia-Fa¹

Abstract A pair of primers designed by WHO reference center of leptospirosis of the Royal Institute of Tropical Diseases in the Netherlands was used to detect leptospirosis. After optimization of reaction conditions and system, the detection of Canine Leptospira with Vibrio cholerae, Salmonella typhi, enterotoxigenic Escherichia coli, pathogenic Escherichia coli, dysentery, alginolytic bacteria, non-O1, O139 Vibrio cholerae, Vibrio paralyticus and O157 were conducted. The results showed that there was no cross reaction between the PCR detection method and the above strains.The results of double strand DNA sensitivity test showed that the PCR method could detect 3×10³ copies of nucleic acid with good specificity and sensitivity, and thus could be used for the detection of Canine Leptospira samples. 

Keywords Canine Leptospira; PCR; detection

钩端螺旋体病（leptospirosis，简称钩体病）是因感染钩端螺旋体（Leptospira spp，简称钩体）所致的一种自然疫源性人兽共患传染病^[1]。犬钩体病主要的致病性血清型有犬型、塔拉索夫型、黄疸出血型等^[2]。各年龄段犬均易感染本病，公犬和幼犬的发病率较高，在感染后急性病例以发热、黄疸、血红蛋白尿、出血性素质为主要特征^[3]。犬钩体病的确诊需要用镜检、病原培养、动物接种、血清学检测等实验室鉴别诊断方法来实现，但以上检测方法往往存在时效性差、检测结果不够准确等缺点。PCR检测相比以上方法，更节约时间成本和人力成本，同时兼具高度特异性和灵敏性，对钩体病具有早期诊断价值。因此，本文旨在验证并对一种犬钩端螺旋体快速、灵敏和准确的PCR检测方法加以应用。

1  材料

1.1 试剂材料

犬钩端螺旋体由本课题组提供。试剂TaKaRa Ex Taq(RR01BM)和引物由大连宝生物（TaKaRa）公司提供和合成；核酸抽提试剂盒MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit为Thermo Fisher公司提供；三羟甲基氨基甲烷（Tris）由美国Bio-Rad公司提供；此外，还包括乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、Tris饱和酚、氢氧化钠、二硫氰酸胍、碳酸氢钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氯化钠、琼脂糖、乙酸、75%乙醇、50×TAE缓冲液、酚氯仿、裂解液、1%～1.6%的琼脂糖凝胶。

1.2 溶液配方

50×TAE缓冲液：将1.8612 g EDTA，24.2000 g Tris溶解于70 mL水中，加5.71 mL冰乙酸，然后定容至100 mL。

1.3 主要仪器

主要仪器名称，产地与生产厂商：KingFisher DUO Prime全自动磁珠提取仪（美国Thermo）、-80℃超低温冰箱（日本SANYO）、超净工作台（上海上净）、Powerpac Universal核酸电泳仪（美国Bio-Rad）、ALLIANCE-LD2-87.WL凝胶成像系统（英国UVI）、梯度PCR仪（美国 Applied Biosystems）、2 μL～1000 μL移液器（德国Eppendorf）、7500 Real Time PCR System（美国Applied Biosystems）、GR60DP型自动蒸汽灭菌锅（中国致微（厦门））、ALLEGRAX-30R离心机（美国Beckman）、Onedrop2000+核酸蛋白浓度测定仪（南京五义科技）、台式低温高速离心机（美国SIGMA 3K15）、电子天平（万分之一）（德国梅特勒）。

1.4 PCR引物

采用荷兰皇家热带病研究院WHO钩体病参考中心设计的一对引物进行普通PCR检测（表1-1）。用BLAST软件对该引物进行核酸序列同源性分析，结果显示该引物核酸序列和钩体相关序列具有一致性，显著区分于其他钩体基因序列，和其他细菌、病毒序列未见相似。

2  试验方法与内容

2.1 犬钩端螺旋体核酸提取

取出犬钩端螺旋体样品在KingFisher DUO Prime全自动磁珠提取仪上用核酸抽提试剂盒MagMAX CORE Nucleic Acid Purification Kit提取核酸，该提取物用作PCR反应的模板，可在-20℃条件下保存备用。其他对比样品的DNA也按照此方法提取。

2.2 PCR反应 

以50 μL量作为常规PCR反应体系。第一次PCR Taq酶1 U、Taq酶自带25 mmol·L^-1Mg²⁺盐4μL、Taq 酶自带10×PCR Buffer 5μL、10 mmol·L^-1mix dNTP 4μL、10 pmol·μL^-1犬的钩体PCR引物1.5μL、待测 DNA样品6μL，加水至50μL。

PCR 反应条件：35个循环；94℃预变性5 min；94℃变性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸30 s；72℃延伸10 min，冷却结束反应。

结果判定：扩增产物经琼脂糖凝胶（1.6%）电泳后放入凝胶成像仪观察，阳性结果可以看到清晰的特异性条带。

2.3 PCR灵敏度试验

在同一反应条件下，用钩体阳性标准品3×10⁷～3×10^-1拷贝作为模板，分别进行PCR扩增。将5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2.4 PCR特异性的测定

将钩体阳性样品及多种常规细菌进行PCR对照，024为霍乱弧菌，129为伤寒杆菌，S217为沙门氏菌，ETEC为产毒性大肠杆菌，EPEC为致病性大肠杆菌，LJ217为痢疾，溶藻菌，155为非O1、O139霍乱弧菌，VP为副溶血性弧菌，O157菌及阴性对照在同一条件下进行PCR扩增。将5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

2.5 PCR临床样品检测

用该PCR方法检测某宠物医院提供的样本17份。

3  结果

3.1 PCR 扩增实验

利用钩体PCR引物对钩体阳性样品DNA扩增，1孔为犬钩体阳性样品，2孔为灭菌水，M.DL 2000，检测结果见图1，目的片段为285 bp ,与预期片段大小相符，无其他非特异性条带出现。

3.2 PCR灵敏度试验

将PCR扩增产物的双链DNA做10倍倍比稀释后，进行PCR扩增，检测结果见图2，M. DL 2000 Marker，1-9孔双链DNA的拷贝数从左至右依次为3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³、3×10²、3×10¹、3×10^-1，10孔为灭菌水，发现双链DNA浓度稀释到3×10³个拷贝仍然能扩增目的条带。

3.3 PCR特异性试验

应用钩体阳性样品及多种常规细菌、阴性对照在同一条件下进行PCR扩增，将5μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3，M.DL 2000 Marker，1孔EPEC为致病性大肠杆菌，2孔129为伤寒杆菌，3孔ETEC为产毒性大肠杆菌，4孔为溶藻菌，5孔S217为沙门，6孔为钩体阳性样品，7孔024为霍乱弧菌，8孔LJ217为痢疾，9孔155为非O1、O139霍乱弧菌，10孔VP为副溶血性弧菌，11孔为O157菌，12孔为阴性对照。结果显示只有钩体阳性样品有扩增，其余样品皆为阴性。表明利用该钩端螺旋体PCR检测方法检测钩体与上述常规细菌无交叉反应，证明该钩端螺旋体PCR检测方法具有特异性。  

3.4 PCR临床样品检测

PCR检测17份临床犬钩体样品，检测结果见图4，1-17孔为17份犬钩体临床样品，M. DL 2000 Marker。结果14份阳性，3份阴性，与提供样品单位的检测结果相符。

4  结论

犬钩体病是因感染致病性钩体所引起，常见对犬致病的血清型有犬型、塔拉索夫型、黄疸出血型等。犬钩体病主要引发犬肝脏及肾脏疾病，不同的血清型能引起不同的临床表现，潜伏期长短也存在明显差异。临床特征主要有发热、呕吐、出血性腹泻、黄疸、肝肾区疼痛，尿液呈豆油色或微棕色，肾功能衰竭等^[2]。

因为钩体病早期缺乏特异性症状，所以该病需要实验室检测进行辅助诊断，如对患病犬进行血常规检查。钩体也可以通过对临床样本（如血液、尿液、脑脊液）进行直接镜检来发现，但这种方法灵敏度低且需要专业人员观察显微镜。采集临床样本进行分离培养和显微镜凝集试验(MAT)是钩体检测的金标准方法，但钩体培养所需时间长，且受专业知识和人力的限制；显微镜凝集试验(MAT) 灵敏度低，多种因素会影响实验结果，结果可比性和准确性不高。酶联免疫吸附试验（ELISA)可以特异性的检测出钩体病原，已较多运用在钩体病的免疫诊断领域^[4]。ELISA方法对比MAT方法具有更高的灵敏度，可用于大批量标本的检测。以聚合酶链式反应(PCR)为代表的分子生物学检测方法无需分离培养病原体，反应的效率、灵敏度、特异性极高，各类DNA序列的扩增和检测方法越来越多地用于钩体的流行病学调查及鉴别诊断中^[5]。PCR检测技术的应用，极大地提升了检测的灵敏度，并且该方法具备钩体病的早期诊断能力^[6]。

本研究以荷兰皇家热带研究院世界卫生组织钩体病参考中心设计的一对引物进行普通PCR检测，能特异性的检测出犬钩端螺旋体，扩增出285bp的特异性片段，而其他种类的病原体(霍乱弧菌，伤寒杆菌，沙门氏菌，产毒性大肠杆菌，致病性大肠杆菌，痢疾，溶藻菌，非O1、O139霍乱弧菌，副溶血性弧菌，O157菌)未扩增出特异性条带，并且该检测方法能扩增出最低3×10³拷贝的被检目的基因，说明该PCR检测方法具有极强的特异性和灵敏度。实验结果证实该方法能为犬钩体病的鉴别诊断提供一种快速、高效、灵敏、特异的技术手段，可用于进口犬只、进境携带伴侣动物等口岸疫病检测的技术储备。

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参考文献

[1] 谈忠鸣,汤奋扬,周璐. Real-time PCR快速检测钩端螺旋体方法的建立[J].中国卫生检验杂志,2011, 21(7): 1701-1702.

[2] 龚悦.犬钩端螺旋体病PCR和荧光定量PCR诊断试剂盒的研制[D].吉林:吉林大学.2015.

[3] 陈溥言.钩端螺旋体病[M].兽医传染病学, 2006: 183-187.

[4] Swapna Rn,Tuteja U,Nairl,Seroprevalence of leptospirosis in high risk group sin Calicut, North Kera1a, Indian [J].Indian JM edMicrobio, 2006, 24 (4): 349-352.

[5] 何随彬,何弘,金耀忠,等.犬钩端螺旋体病的诊断和防治[J].上海畜牧兽医通讯,2018, (01):46-48.

[6] Ooteman MC, Vago AR, KOURY MC. Evaluation of MAT, IgM ELISA and PCR methods for the diagnosis of human leptospirosis [J].J Microbiol Methods, 2006, 65(2): 247- 257.

 （文章类别：CPST-B）