丁 宁¹ 吕 飞² 刘敏慧³ 赵旭伟⁴ 伍和平² 沈 鸿² 蒋小良^3*

摘 要 利用QuEChERS-固相萃取法结合高效液相色谱—串联质谱法检测猪肾中氟虫腈及其3个代谢物残留量。样品用甲酸乙腈和商品化多兽残QuEChERS盐包提取，采用固相萃取净化，外标法定量。在不同浓度的加标水平下，氟虫腈及其代谢物在猪肾中的平均回收率为95.3%～105.7%，相对标准偏差为2.68%～7.58%，方法检出限在0.0033 μg/kg～0.50 μg/kg，定量限在0.011μg/kg～1.50μg/kg范围内。该方法高效、简单、准确、灵敏，适用于对猪肾样品氟虫腈及其3种代谢物的快速定量分析。

关键词 QuEChERS；UHPLC-MS/MS；猪肾；氟虫腈及其代谢物

 Rapid Detection of Fipronil and its Metabolite Residues in Pid Kidney by solid Phase Extraction-QuEChERS-combined with high Performance Liquid Chromatography-tandem mass Spectrometry

DING Ning¹  LV Fei²  LIU Min-Hui³  ZHAO Xu-Wei⁴

WU He-Ping²  SHEN Hong²  JIANG Xiao-Liang^3*

Abstract The QuEChERS-solid phase extraction(SPE) combined with high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was used to detect the residues of fipronil and its three metabolites in pig kidney. The samples were extracted with methane acetonitrile and QuEChERS Salt package, purified by SPE, quantified by external standard method. At different concentrations, the average recoveries of fipronil and its metabolites in pig kidney were in range of 95.3%~105.7%，with RSD in the range of 2.68%~7.58%, the LOD was in the range of 0.0033μg/kg~0.50μg/kg, and LOQ was in the range of 0.011μg/kg~1.50μg/kg. The method is efficient, simple, accurate and sensitive, which is suitable for rapid quantitative detection of fipronil and its three metabolites in pig kidney.

Keywords QuEChERS; UHPLC-MS/MS ; pig kidney; fipronil and its metabolites

氟虫腈是由法国罗纳-普郎克农化公司在1987年研制的一种苯基吡唑类广谱杀虫剂，锐劲特是其商标名称，英文名为Fipronil, 可以杀灭跳蚤、虱子、蜱虫、蟑螂、螨虫等^[1-2]，被世界卫生组织列为“对人类有中度毒性”的化学品，其代谢物具有更高的毒性。含有高浓度氟虫腈残留的动物性食品进入人体内，可引起人体甲状腺和肾脏等器官的严重损害^[3]。欧盟委员会相关的法律法规要求，氟虫腈在食品中的最大残留量为0.005 mg/kg ^[4] ；国际食品法典委员会规定禽肉中氟虫腈的最大残留量值为0.02 mg/kg，禽蛋中则为0.01 mg/kg^[5]；我国在2009年2月25日《中华人民共和国农业部公告》（第1157号文件）明确了自2009年10月1日起除卫生用、玉米等部分旱田包衣剂外，禁止氟虫腈在其他方面使用。2017年9月15日《中华人民共和国农业部公告》（第2583号文件）禁止非泼罗尼及相关制剂用于食用动物， GB 2763-2019规定氟虫腈残留物是氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜之和，牛肝中最大残留限量为0.1 mg/kg，牛肾中最大残留限量为0.02 mg/kg，禽肉类最大残留限量为0.01 mg/kg，禽类内脏最大残留限量为0.02 mg/kg^[6]。

2017年8月，欧洲“毒鸡蛋”事件曝光，欧洲、亚洲近20个国家或地区受到波及，数以百万计的鸡蛋被下架回收，数十个家禽养殖场被关闭，影响非常严重。这次事件暴发的原因，主要是因为荷兰、英国、法国等欧洲国家的相关养鸡场为鸡场消杀螨虱时，使用了含有氟虫腈的杀虫剂，间接造成被污染后的鸡蛋检出氟虫腈残留物。

目前，对于动物组织样品中氟虫腈及其代谢物的检测方法主要有液相色谱-串联质谱法^[7-10]、气相色谱-质谱法^[11-12]、气相色谱-串联质谱法^[13]及四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱法^[14-15]，但未见有对猪肾样品的相关报导；现行有效的标准中可以对于动物组织进行氟虫腈检测的是SN/T 1982-2007和GB 23200.34-2016，但仅仅针对原药，而且前者适用样品仅涉及到肉及肉制品，后者主要适用于谷物，其他食品参照执行，而且前处理方法复杂耗时。

QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)方法于2003年由Michelangelo等^[16]提出，因操作方便、价格低廉、高效快速以及准确等特点，被广泛应用于相关农药残留和兽药残留检测领域^[17]。本研究利用QuEChERS法提取，固相萃取净化，建立了猪肾中氟虫腈及其代谢物的高效液相色谱-串联质谱法，该方法较GB 23200.34-2016法前处理简便快捷，省时省力，大幅提高检测效率，同时相关系数、回收率、精密度、检出限和定量限都满足实验室检测要求，适用于猪肾中氟虫腈及其代谢物快速定量分析。

1  实验部分

1.1 仪器和试剂

液相色谱-质谱/质谱仪［Waters Xevo TQ-S micro，配备电喷雾离子源（ESI）］；超纯水器（美国密理博公司）；UVS-1涡旋振荡器（北京优晟联合科技有限公司）；组织研磨仪（上海禹熠仪器有限公司）；GM200刀式捣磨仪（德国Retsch公司）；TGL-17M台式高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司 ）；AG-SPE-12D固相萃取仪（上海欧戈电子有限公司）；0.22μm有机相微孔滤膜。氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈的标准储备液（ANPEL），均由百灵威科技有限公司提供，甲酸、乙腈等试剂，均由广州化学试剂厂提供。

1.2 标准溶液的配制

分别取50μL浓度为100μg/mL氟虫腈及3种代谢物的标准储备溶液，配制成500μg/L的标准工作液，用甲醇定容。

1.3 仪器分析条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈（1.7 μm，2.1×50 mm）；柱温40℃；进样量1μL；流速：0.45 mL/min；流动相A：0.1%甲酸溶液，B：0.1%甲酸乙腈溶液，溶剂梯度（时间min/甲酸水：0.1%甲酸乙腈）：  0 min （90∶10），2 min（10∶90），4 min （10∶90），4.01 min （90∶10），5 min （90∶10）。梯度洗脱程序见表1，整个分析时长为5 min。

表1  梯度洗脱程序参数

Table 1  Parameters for procedure of gradient elution

三重四级杆质谱仪配备的是电喷雾离子源，采用负离子 ESI-模式；MRM多反应离子检测模式，毛细管电压：3.5 KV；锥孔电压：24 V，离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流速： 1000 L/Hr。待测化合物具体多反应监测参数见表2。

表2  多反应监测参数

Table 2  Multi reaction monitoring parameters

图1  氟虫腈及三个代谢物色谱图

Fig.1  Chromatogram of fipronil and its three metabolites

图2  氟虫腈及三个代谢物的线性回归曲线

Fig.2  Linear regression curve of fipronil and its three metabolites

1.4 样品的前处理

准确称取处理好的猪肾样品5 g±0.01 g，精确到0.001 g，置于50 mL 离心管中，加入5 mL 5%甲酸乙腈，涡旋混合30 s，加入QuEChERS多兽残提取盐包（1 g氯化钠、4 g无水硫酸镁、1 g二水合柠檬酸三钠、0.5 g半水柠檬酸氢二钠），震荡提取30 s，以8000 r/min在10℃条件下离心5 min，吸取上清液2 mL待净化。固相萃取柱用10 mL SPE溶液预淋洗后，转入上述样品提取液2 mL，收集流出液。再用30 mL SPE溶液洗涤固相萃取柱，然后合并固相萃取柱中流出液，控制固相萃取净化过程流速不超过2 mL/min。将流出液收集到100 mL圆形锥形瓶中，并在40℃下真空旋转蒸发至近干。残留物先用0.4 mL乙腈溶解再用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，涡旋混匀后，过0.22μm微孔滤膜，随同做空白试验，待测。

2  结果与讨论

2.1 标准曲线与相关系数

参照GB 23200.34-2016分别吸取10、20、40、150、250（μL）混合标准工作液添加到5份用猪肾空白样品基质提取净化后的溶液中，定容后试样浓度分别为1、2、4、15、25（μg/kg）。按照1.3的仪器条件分析，外标法定量，以氟虫腈及其3个代谢物的峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线。结果表明：该方法氟虫腈及其3个代谢物在1μg/kg～25μg/kg范围内呈良好的线性关系，r²≥0.990,相关色谱图见图1，标准曲线图见图2。

2.2 方法的检测限和定量限

在10份5±0.01 g空白猪肾样品中每份加入20μL标准工作液，使其质量浓度均为2 ug/kg, 按照1.2.2和1.2.3的方法处理和分析，取其平均信噪比（S/N）计算按照：

方法检出限= 和方法定量限=

计算各目标分析物的方法检出限及定量限，详见表3。由表3可见，该方法氟虫腈及其3个代谢物的定量限远远低于GB 23200.34-2016的定量限要求。

2.3 分析方法的准确度与精密度

在18个5±0.01 g空白猪肾样品中进行三个梯度水平试验，每个梯度6个样品，三个梯度分别加入2、5、20μg/L标准工作液，使其成为含有一定量的阳性样品, 按照1.4的方法处理和1.3条件进行测试分析，测试结果详见表4，计算准确度（加标回收率）及相对标准偏差（RSD，精密度）。由表4可见，氟虫腈及其3个代谢物在猪肾中的平均加标回收率在95.3%～105.7%范围内，相对标准偏差RSD为2.68%～7.58%。

表3  方法检出限与定量限

Table 3  Limit of detection and limit of quantification of the method

表4  氟虫腈及其3个代谢物的回收率和精密度

Table 4  Recovery and precision of fipronil and its three metabolites

3  结论

本研究建立了QuEChERS技术-固相萃取结合高效液相色谱-串联质谱检测猪肾中氟虫腈及其3个代谢物残留的分析方法。

经验证，氟虫腈及3个代谢物在1μg/kg～25μg/kg范围内呈良好的线性关系，线性相关系数r²均大于0.990，方法检出限均小于0.50μg/kg。氟虫腈及其3个代谢物不同水平加标平均回收率为95.3%～105.7%，相对标准偏差RSD为2.68%～7.58%。研究表明，该方法较国标法可大幅度提高效率，各项指标也符合检测要求，可用作猪肾中氟虫腈及其代谢物的残留检测。

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参考文献

[1]吕冰,尹帅星,陈达炜,等.Qu EChERS-四级杆/静电场轨道肼高分辨质谱测定动物源性食品中氟虫腈及其代谢物残留[J].分析测试学报, 2017, 36(12): 1424-1430.

[2] Li A,Yang Y,Wu S ,et al .Investigation of mechanisms to fipronil in dia mondback moh (Lepidoptera:plutellidae) [J].Journal of Economic Entomology, 2006, 99(3): 914-919.

[3] HAINZL D,CASIDA J .Fipronil insecticide:Novel photochemical desulfiny-lation with retention of neurotoxicity [J].Proceedings of the national academy of sciseces, 1996, 93(23): 12764-12767.

[4] Commission European. Pesticide Residues and Maximum Residue Levels(PartA of Annex I to Reg. 396/2005) [S].

[5] Commission Codex Alimentarius.Pesticide Residues in food and Feed, (2016-07-01) [S].

[6] GB2763-2019:《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》[S].

[7]冯程程,刘新刚,董丰收,等. 5种动物源性食品种的氟虫腈及其3个代谢物残留量检测[J].植物保护, 2019, 45(5): 207-213.

[8]黎小鹏,梁雪琪,陈南,等.超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪检测动物源性食品中氟虫腈及其代谢物[J].安徽农业科学, 2019, 47(14): 204-206.

[9]宁霄,金绍明,高文超,等. QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中氟虫腈及其代谢物残留[J].分析化学, 2018, 46(8)1297-1305.

[10]夏义平,尹啸水,林肖惠,等. QuEChERS-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法快速测定鸡蛋和鸡肉中氟虫腈及其代谢物[J].中国食品卫生杂志, 2018, 30(4): 395-400.

[11]罗亮. QuEChERS-气相色谱-质谱法测定3种食品中11种农药残留[J].食品安全质量检测学报, 2019, 10(21): 7388-7394.

[12艳丽,陈克云,梁秀清,等.分散固相萃取/气相色谱质谱法测定动物源性食品中的氟虫腈及其代谢物[J].分析测试学报, 2018, 37(4): 440-445.

[13]陈沙,朱作为,黄宗兰,等.气相色谱三重四级杆串联质谱法测定鸡蛋和鸡肉中氟虫腈及其代谢物残留量的研究[J].食品安全质量检测学报. 2018, 9(6): 1284-1289.

[14]吕冰,尹帅星,陈达炜,等.QuEChERS-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定动物源性食品中氟虫腈及其代谢物残留[J].分析测试学报, 2017, 36(12): 1424-1430.

[15]刘善菁,刘雨昕, 陆桂萍, 等.液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱测定鸡蛋及鸡肉中氟虫腈及其代谢物残留的研究[J].中国兽药杂志. 2017, 51(10): 29-38.

[16] MICHELANGELO A.STEVEN J L.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solid-phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce[J].Journal of AOAC International, 2003. 86(2): 412-431.

[17] GONZÁLEZ-CURBELO M. Á., SOCAS-RODRÍGUEZ B., HERRERA-HERRERA A. V., et al. Evolution and applications of the Qu ECh ERS  method[J]. Tr AC Trends in Analytical Chemistry, 2015, 71: 169-185.

（文章类别：CPST-B）