李芳 ¹ 范孝英 ¹ 赖梦书 ² 刘燕 ¹ 吕廷保 ¹ 鲁发翠 ¹ 高燕 ¹ 陈丽萍 ^1*

摘 要 为保证测量结果的准确性，对商品试剂盒微生物法测定鸡枞菌中叶酸含量不确定度进行分析。依据CNAS-CL01-G003-2019要求，并按照JJF 1059.1-2012和GB/Z 22553-2010对实验结果有影响的各个分量进行评估，即对样品测定重复性、样品称量、样品检测过程三个方面引入的不确定度进行分析，并确定了各不确定度分量，得出扩展不确定度。各分量不确定度从大到小分别为样品测定重复性0.0272、移液枪自身容差0.0226、标准品纯度0.002887、温度变化0.0006、容量瓶定容0.0006、样品称量0.00001633；相对合成标准不确定度为0.0356，扩展不确定度为7.7857，测量结果为（109.35 ±7.7857）μg/100 g。影响微生物法测定鸡枞菌中叶酸含量的最主要不确定度分量为样品测定重复性、移液枪自身容差、标准品纯度引入的不确定度。

关键词 微生物法；叶酸；不确定度；评估

 Uncertainty Evaluation in Determination of Folic Acid in  Termitornyces Eurhizus  (Berk.)R.Heim by Microbiological Method

LI Fang¹  FAN Xiao-Ying¹  LAI Meng-Shu²  LIU Yan¹  LV Ting-Bao¹

LU Fa-Cui¹  GAO Yan¹  CHEN Li-Ping^1*

Abstract To guarantee the accuracy of the measurement results, this study analyzed the uncertainty in  determination of folic acid in Termitornyces eurhizus (Berk.) R.Heim by microbial testing kit. The sources of uncertainty for this method were explored according to CNAS-CL01-G003-2019, GB/Z22553-2010, and JJF 1059.1-2012. That is to analyze the uncertainty introduced from sample determination repeatability, sample weighing and sample testing process, to ascertain standard uncertainty components and expanded uncertainty. The uncertainty components in ascending order included method repeatability at 0.0272, tolerance of pipetting gun at 0.0226, purity of standard product at 0.002887, temperature change at 0.0006, volumetric bottle constant capacity at 0.0006, and sample weighing at 0.00001633; the relative combined standard uncertainty was 0.0356, the expanded uncertainty 7.7857, and the measurement results (109.35 ±7.7857)μg/100g. The key uncertainty components that influenced the results of determination of folic acid in Termitornyces eurhizus (Berk.) R.Heim were method repeatability, pipette gun tolerance and uncertainty introduced by standard purity.

Keywords microbial method; folic acid; uncertainty; assessment

基金项目：特色高值农产品新型甄别检测关键技术研究（2017YFF0211300），特色高值农产品真伪和身份精准甄别技术研究（2017YFF0211301）

第一作者：李芳（1993—），女，汉族，云南曲靖人，助理工程师，研究方向为食品安全检测，E-mail：1787715208@qq.com

通讯作者：陈丽萍（1981—），女，汉族，昆明人，高级工程师，研究方向为食品安全检测及品种鉴定，E-mail：55490875@qq.com

1.昆明海关技术中心  昆明  650200 

2.河口海关综合技术服务中心  河口  661300

1. Technical Center of Kunming Customs District, Kunming  650200 

2. Hekou Customs Comprehensive Technical Service Center, Hekou  661300

鸡枞菌（Termitornyces eurhizus (Berk.)R.Heim）肉厚肥硕，质细丝白，味道鲜甜香脆，为菌中之冠^[1]，与等翅目大白蚁亚科昆虫共生，目前难以进行人工繁殖，全球共有40个鸡枞菌种类被报道和描述，其中，中国云南地区分布的鸡枞菌种类有20种，云南是鸡枞菌商菇产出和贸易最大的省份^[2]。鸡枞菌含有多种人体所必需的营养成分，如维生素、糖类、氨基酸、矿物质元素等，具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节、降血脂及保肝等多种药理作用^[3]。至今关于野生菌中叶酸的含量报道，也是重要关注点，为支持野生菌产业的发展，打响地方地理标志产品品牌^[4]，目前已有研究机构和企业有检测鸡枞菌中叶酸的要求。

叶酸又称维生素B₉，是人体许多生化反应的重要辅酶，缺乏可导致新生儿神经管畸形，引起细胞性贫血和粒细胞减少^[5]。所以，叶酸的每日补充量及其毒理学作用的研究都是当前的热门课题，而准确测出食品中叶酸的含量是研究这些问题的前提和基础^[6]。使用仪器检测法只是对叶酸的某种结构和叶酸的衍生物进行检测分析，但是对叶酸的所有结构形式测定进行分析时，实验难度加大和复杂度增高，成本变高^[7]。微生物法可以测定具有生化活性的叶酸，即检测基体中的叶酸所有结构形式含量，这是微生物法不同于其他检测方法的最大优点^[8]。

新版国家标准GB 5009.211-2014《食品安全国家标准 食品中叶酸的测定》中叶酸的测定仅有微生物法，但标准方法操作复杂繁琐，结果不稳定^[9]，然而商品试剂盒可以大幅缩短试验操作时间，降低试验难度，灵敏度高，稳定性好，重现性高且可操作性强^[10]。

商品试剂盒虽然性质稳定，但是测量过程中会因提取试剂配制、样品前处理、检测设备、测量仪器、电子天平、移液枪等原因不可避免地产生不确定度^[11-13]。当叶酸检测值含量接近标准中规定的限量值时，就需要借助不确定度对实验结果是否符合标准限量值规定进行符合性判定^[14-15]。本研究按照CNAS-CL01-G003-2019《测量不确定度的要求》之规定，并依据GB/Z 22553-2010和JJF 1059.1-2012对检测过程中影响实验结果的各个分量进行评估，得出扩展不确定度^[16]。

1  实验所用试剂、仪器设备与方法步骤

1.1 试剂与仪器

用于检测鸡枞菌中的叶酸含量的为拜发VitaFast^®Folic Acid试剂盒；电子天平（LE204E）用于样品的称重；恒温培养箱（SLI-1201），用于试验培养；电子恒温搅拌水箱（HH-60），购于常州国华电器有限公司；多功能全波长酶标仪（美国BIO-Tek），用于测量微孔板吸光度值；快速混匀器（XK80-A），购于江苏新康医疗器械有限公司；移液器。

1.2 试验方法

准确称取5 g，精确至0.0001 g，均质样品和10 mg鸡胰酶放入一个50 mL 离心管中，加入约30 mL磷酸盐缓冲液（0.05 mol/L；0.1%抗坏血酸盐；调节pH至7.2±0.1，新鲜配制），摇匀，加磷酸盐缓冲液至40 mL。在37℃黑暗条件下孵育2 h（其间不时振荡）。然后确保离心管拧紧，95℃水浴加热30 min，振荡至少5次。迅速冷却至室温。离心，取上清液。样品提取液稀释浓度1∶8已包含在标准曲线中，再根据具体情况进行样液稀释，确定浓度范围后在2 mL无菌离心管中进行稀释。 

严格按照试剂盒说明书的方法步骤配制培养基和浓度依次为0、0.16、0.32、0.64、0.96、1.28μg/100 g的6管标准品溶液。

根据实验需要准备相应数量的微孔条，分别加入培养基和各浓度标准品溶液或稀释的样品液于指定的微孔中，每孔总体积为300μL。加样完成后密封微孔条，按照规定的温度黑暗条件下培养44 h～48 h，使用酶标仪在规定波长条件下读取培养液吸光度值。

1.3 数学计算公式

鸡枞菌中的叶酸（μg/100g）含量按以下公式计算：

叶酸含量（X）=样品在标准曲线上计算出的浓度（c）×样品稀释倍数（n）/样品量（m）

所以叶酸（X）的相对标准不确定度计算公式为：

1.4 不确定度分量评定^[17]

(1)试剂盒中标准品纯度带入的不确定度、样品重复测定带入的不确定度，是影响样品在标准曲线上读取的叶酸浓度（C）测定不确定度的分量。

(2)电子天平自身精密度是影响样品称量结果（m）不确定度的分量。

(3)容量瓶、温度变化、10～100μL、200μL、100～1000μL移液器自身容差引入的不确定度是影响样品检测过程（n）不确定度的分量。

2  结果与分析

2.1 鸡枞菌中叶酸含量检测过程带入的不确定度

2.1.1 标准品纯度的不确定度  叶酸标准品纯度由试剂公司给出纯度≥99%，假设纯度在99%～100%范围内，服从矩形分布，取中间值99.5%，叶酸标准品纯度引入的相对标准不确定度为：

2.1.2 样品重复测定引入的不确定度^[18]

2.1.2.1 酶标仪读数引入的不确定度 　 

校准证书上该酶标仪读数最大允许误差为0.015，服从矩形分布，则酶标仪引入的相对标准不确定度为：

2.1.2.2 测定重复性的不确定度

在重复条件下，该样品进行12次独立测量后（n=12），结果见表1。

表1  样品叶酸含量重复测定结果

Table 1  Results of repeated determination of folic acid content in samples

根据贝塞尔公式，随机效应导致的标准不确定度为：

相对不确定度为：

样品重复测定引入的相对标准不确定度为：

样品平行检测12次，叶酸浓度测定引入的相对标准不确定度为：

2.2 样品称量引入的不确定度

选用精密度为0.0001 g的电子天平称重样品，鉴定证书上该天平最大允许误差为±0.0001 g。实验中称取样品5.0000 g，取矩形分布，称样带来的不确定度为：

则其相对标准不确定度分别为：

2.3 样品检测过程引入的不确定度^[19]

样品稀释液配制过程中使用了100 mL容量瓶，玻璃量器的容量允差U（VA）以及环境温度变化产生的误差U（VT）是100 mL A级容量瓶的标准不确定度分量。20℃时100 mL A级容量瓶的容量允差为0.10 mL,取均匀分布,则其不确定度为：

其相对标准不确定度为：

实验室温度变化在15～25℃之间，水的膨胀系数为2.1×10^-4/℃。按照矩形分布计算其标准不确定度为：

其相对标准不确定度为：

100μL、1 mL、200μL移液枪引入的不确定度  按照JJG 646-2006《移液器检定规程》的规定，20℃时100μL的移液枪使用范围内最大允许误差为±2.0μL、1 mL的移液枪使用范围内最大允许误差为±10μL，取均匀分布，由此带来的不确定度分别为：

100μL移液枪在本次实验中的使用量程为100μL，其相对标准不确定度为：

1mL移液枪在本次实验中的使用量程为900μL，400μL,其相对标准不确定度为：

  200μL移液枪在本次实验中的使用量程为150μL，20℃时该移液枪量程取值范围内容量允许误差最大值为±3.0μL，取均匀分布，则相对标准不确定度为：

样品检测过程相对合成标准不确定度为：

2.4 叶酸测定的不确定度分量

叶酸检测过程中带入的不确定度分量见表2。假设样品充分混匀，可不考虑均匀性带入的不确定度分量，试样中叶酸的相对合成不确定度为：

表2  不确定度分量表

Table 2  Components of uncertainty

2.5 扩展不确定度及测定结果

根据公式 ，则合成标准不确定度为，扩展不确定度可由合成标准不确定度乘以包含因子得到，即；取 k=2，式中U_rel(x)表示叶酸的相对合成不确定度；U_(x)表示合成标准不确定度；X表示样品鸡枞菌中叶酸含量；U_x表示扩展不确定度。根据计算得到样品鸡枞菌中叶酸含量为109.35μg/100ｇ，则鸡枞菌中叶酸含量的扩展不确定度为：

鸡枞菌中叶酸含量为：

X=（109.35±7.7857）μg/100g（k=2） 

3  结论

本文综述了鸡枞菌中叶酸含量检测过程中不确定度的来源、测定步骤及其计算。采用微生物法测定鸡枞菌中叶酸含量，结果为(109.35±7.7857)μg/100g（k=2）。本实验选用商品化试剂盒，菌种为试剂盒中原有，所以无法检测菌种活力、接种菌种数量两方面生物因子带入的不确定度，因此仅能从标准曲线上读取的叶酸浓度（C）、样品称量结果（m）、样品检测过程（n）三方面进行不确定度评估。实验结果表明，各分量不确定度从大到小分别为样品测定重复性0.0272、移液枪自身容差0.0226、标准品纯度0.002887、温度变化0.0006、容量瓶定容0.0006、样品称量0.00001633；不确定度的主要来源由样品测定重复性、移液枪自身容差和标准品纯度引入的不确定度。

本文分析表明，若采购的标准品的纯度和浓度较高，需对实验中使用的玻璃器皿容量瓶、电子天平和移液枪进行定期检定，对所使用的酶标仪进行定期校准，并严格按照仪器操作规程操作，能够较大程度地减少上述非生物因素带来的不确定度。

【该文经CNKI学术不端文献检测系统检测，总文字复制比为3.1%。】

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 （文章类别：CPST-C）