刘敏慧¹ 谢思瑶¹ 魏晓恒¹ 胡业明¹ 许瀛丹² 吴瑞茹² 蒋小良^1*

摘 要 采用水-甲醇（1:1，V/V）溶液超声波辅助萃取，建立了同时快速测定贝类中砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸、砷酸和4-氨基苯胂酸等5种砷形态的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS）分析方法。对萃取溶液浓度、超声波辅助萃取温度和时间等条件进行了优化。选用Hamilton PRP-X100阴离子分析柱，以50 mmol/L碳酸铵-甲醇（99:1，V/V）溶液为流动相，进行梯度洗脱对5种砷形态分离，并优化了质谱测试条件。试验结果表明，5种砷形态达到很好的分离效果，在质量浓度为0～100μg/L的范围内与其对应的峰面积均具有良好的线性关系，线性相关系数r²均大于0.999，检出限在0.2～0.60μg/L之间，两水平样品加标回收率在90.5%～103.5%之间，方法的精密度在1.6%～4.2%之间。

关键词 贝类；砷形态；高效液相色谱；电感耦合等离子体质谱法

 Simultaneous Determination of 5 Arsenic Species in Shellfish by HPLC-ICP-MS

LIU Min-Hui¹  XIE Si-Yao¹  WEI Xiao-Heng¹  HU Ye-Ming¹

XU Ying-Dan²  WU Rui-Ru²  JIANG Xiao-Liang^1* 

Abstract A method was developed for the simultaneous and rapid determination of arsenic choline, arsenic betaine, arsenous acid, arsenic acid  and 4-aminophenylarsonic acid in shellfish through high performance liquid chromatography - inductively coupled plasma mass spectrometry (HPLC-ICP-MS), with samples extraction by oscillating in water-methanol（1:1,V/V）. The concentration of extraction solution, ultrasonic-assisted extraction temperature and time  were optimized. An anion-exchange column (Hamilton PRP-X100) was found suitable the simultaneous separation inorganic and organic species. Five compounds were separated using 50 m mol/L (NH₄)₂CO₃-methanol（99:1,V/V）with a gradient elution, and ICP-MS conditions was optimized. The results showed that the five kinds of arsenic species can reach the baseline separation, and the arsenic concentration in the range of 0 -100μg/L is linear, with correlation coefficients(r²) of all more than 0.999, and the detection limit was from 0.2μg/L to 0.6μg/L. The two levels of sample standard addition recovery rate range from 90.5% to 103.5%, the precision of the method is between 1.6% to 4.2%.

Keywords shellfish; arsenic species; high performance liquid chromatography; inductively coupled plasma mass spectrometry

基金项目：江门市基础与理论科技计划项目（ 2020JC03020 ）

第一作者：刘敏慧（1969—），女，本科，工程师，研究方向为食品及食品包装材料分析检测工作，E-mail：68878699@qq.com

通讯作者：蒋小良（1979—），男，硕士，高级工程师，研究方向为食品及食品包装材料分析检测工作， E-mail：liang96@yeah.net

1.江门海关  江门  529000

2. 中国检验认证集团广东有限公司江门分公司  江门  529000

1. Jiangmen Customs,Jiangmen  529000

2. China Certification & Inspection and Group Guangdong Co., Ltd Jiangmen Branch, Jiangmen  529000

贝类是我国最重要的水产品之一，年产量高达1400万吨，贝类及其加工食品在我国渔业经济贸易中占有极其重要的地位^[1-2]。贝类中的重金属含量，与其生活的水体环境质量息息相关，常见的重金属污染有砷、汞、铅、镉等。由于贝类对砷的富集能力强，所以在贝类中砷含量高于其他水产品。人体吸入过量的砷会对免疫系统、神经系统和造血系统等造成一定的损伤^[3]。砷对人体的毒性不仅仅与其含量有关，最主要的是由其存在的形态决定，日常中砷形态主要有：砷胆碱(AsC)、亚砷酸[As(Ⅲ)]、砷酸[As(Ⅴ)] 、砷甜菜碱(AsB)和4-氨基苯胂酸（p-ASA）等，其毒性依次为As(Ⅲ)＞As(Ⅴ) ＞ p-ASA＞AsC＞AsB^[4]。

目前，砷形态分析主要方法有：高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法^[4-6]、高效液相色谱-原子荧光光谱法^[7-9]、离子色谱-电感耦合等离子体质谱法^[10]、毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法^[11]和原子荧光光谱法^[12-13]等。本文采用超声辅助萃取的前处理方式，通过实验选择了0.5 mmol/L (NH₄)₂CO₃-甲醇(99:1)为萃取溶液，在超声波条件下萃取后，利用高选择性、高灵敏度等高效液相色谱技术（HPLC）和电感耦合等离子体质谱技术（ICP-MS）相结合，建立了同时快速测定贝类中5种砷形态的分析方法。

1  材料与方法

1.1 材料与仪器

砷胆碱(AsC)、砷甜菜碱(AsB)、亚砷酸[As(Ⅲ)]、砷酸[As(Ⅴ)]和4-氨基苯胂酸（p-ASA），均购自国家标准物质研究中心。甲醇(TIDEA HPLC级，德国Merck公司)；碳酸铵（优级纯，德国默克Sigma-Aldrich公司）；冰乙酸（优级纯，广州化学试剂厂）。

7700X型电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，美国安捷伦公司）； 1100型高效液相色谱仪（LC，美国安捷伦公司）；BSA124S型电子天平（德国赛多利斯公司）；Milli-Q型超纯水系统（美国密理博公司）；S-18KS高速离心机（德国SIGMA公司）；XY-CS-HP高频率超声波清洗仪（上海昕仪仪器仪表有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

取常见的海产贝类牡蛎、扇贝、文蛤等（均购于江门本地海鲜市场），取可食用部分进行均质后，再精密称取样品2.00 g（精确至0.01 g）于50 mL塑料具塞刻度离心管中，加入30 mL 水-甲醇(1:1)(pH8.5)溶液，放置于80℃恒温超声波中，超声波萃取75 min后取出，冷却至室温后再加入2 mL冰醋酸，用水定容至50 mL，静置，取5 mL上层溶液，用0.22μm水相滤膜过滤至10 mL的离心管中，以转速为12000 r/min离心5 min后，静置，吸取上清液至进样小瓶供高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪分析其砷形态。

1.2.2 仪器工作条件

高效液相色谱仪工作条件和电感耦合等离子体质谱仪工作条件见表1，流动相A为水相，流动相B为50 mmol/L (NH₄)₂CO₃-甲醇(99:1)(pH=8.5)，梯度洗脱程序见表2，整个分析时长为20 min。

表1  仪器工作条件

Table 1  Instrument working conditions

表2  梯度洗脱程序参数

Table 2  Parameters for procedure of gradient elution

2  结果与讨论

2.1 样品前处理的优化

2.1.1 萃取溶液的选择

考察不同萃取溶液萃取效率，试验了甲醇-水(1:l，V/V)、超纯水、水-乙酸(19:l，V/V)和0.5 mmol/L (NH4)2CO3- 甲醇 (99:1，V/V；pH= 8.5)等4种常用的萃取溶液。采用超声波辅助萃取方式，设定萃取温度80℃，萃取时间为50 min，4种萃取溶液的萃取效率实验结果见表3。

表 3  不同萃取溶液对5种砷形态萃取效果的影响

Table 3  Effect of different extraction solutions on the extraction of five arsenic species

由表3可见，实验选择的4种萃取溶液对贝类样品中5种砷形态的萃取效率存在明显差异，其中采用0.5 mmol/L (NH₄)₂CO₃-甲醇(99:1，V/V；pH= 8.5)萃取溶液的萃取效率明显高于其他3种萃取溶液。因此，实验选择的萃取溶液为0.5 mmol/L (NH₄)₂CO₃-甲醇(99:1)。

2.1.2 萃取温度的选择

选择0.5 mmol/L (NH₄)₂CO₃-甲醇(99:1，V/V ；pH= 8.5)为萃取溶液，采用超声波辅助萃取方式，分别考察萃取温度为50℃、60℃、70℃、80℃和90℃时，对贝类中5种砷形态萃取效果的影响，实验结果见表4。

表 4  萃取温度对5种砷形态萃取效果的影响

Table 4  Effect of extraction temperature on the extraction of five arsenic species

由表4可见，随着萃取温度的升高，5种砷形态萃取效率不断提高，当温度达到80℃时，5种砷形态的萃取效率基本达到最大值，继续升高萃取温度到90℃，超声波辅助萃取基本达到了动态平衡。所以，本实验选择的萃取温度为80℃。

2.1.3 萃取时间的选择

采用超声波辅助萃取方式，选择0.5 mmol/L (NH₄)₂CO₃-甲醇(99:1，V/V；pH= 8.5)为萃取溶液，固定萃取温度为80℃，分别考察萃取时间为30 min、45 min、60 min、75 min和90 min时，对5种砷形态萃取效果的影响，实验结果见表5。

表 5  萃取时间对5种砷形态萃取效果的影响

Table 5  Effect of extraction time on the extraction of five arsenic species

由表5可见，随着萃取时间的不断加长，5种砷形态萃取效率不断提升，当萃取时间为40～50 min时，5种砷形态的萃取效率基本上达到最大值，因此，实验选择最佳的萃取时间为45 min。

2.2 射频功率优化

仪器推荐最佳的射频功率是1550 W，主要是综合考虑了对轻质量元素、中质量元素、重质量元素的影响。本实验只是检测75As，为了验证对于As元素的最佳射频功率。实验考察了射频功率为1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600 W对应的灵敏度及氧化物、双电荷情况。实验结果表明，灵敏度随着射频功率的增加呈现先增后略减的趋势，当射频功率在1450 ~ 1500 W时，灵敏度最高，选择最佳射频功率为1450 W。

2.3 线性方程和检出限

按照1.2.2仪器工作条件及相关分析方法，分别进样5种砷形态化合物混合标准工作溶液进行分析，砷胆碱(AsC)等5种砷形态混合标准工作溶液质量浓度依次为0、10、20、40、60、80、100μg/L。5种砷形态化合物的色谱图如图1所示，以质量浓度为横坐标(x)，对应的峰面积为纵坐标(y)绘制标准工作曲线，并进行线性回归见表6，结果表明5种砷形态在0 ~ 100μg/L范围内具有良好线性关系，相关系数均大于0.999。

表 6  5种砷形态化合物线性参数及检出限

Table 6  Linear parameters and detection limits of five arsenic compounds

2.4 方法学验证

为了验证所建立方法的准确性，随机抽取贝类样品进行精密度和加标回收率的考察。取空白样品6份分别添加两个不同浓度水平的5种砷形态的混合标准溶液，结果见表7。

表7  加标回收率及精密度结果

Table 7  Recovering rate and precision of Standard Sample

       注：n=6，ND = Not detectable

由表7可以看出，5种砷形态的两个水平梯度加标回收率为90.5%～103.5%，说明该方法具有较高的准确性和测试可靠性。

图1  5种砷形态混合标准溶液的色谱图

Fig.1  Chromatograms of mixed standard solutions of five arsenic species

2.5 样品分析

按照1.2.1实验方法对海螺、毛蛤和尖螺等三种贝类样品进行前处理，并按照1.2.2仪器工作条件进行测定，每个样品平行测定11次，取其平均值为测定结果，并同采用标准方法GB 5009.11-2014测定值进行比较，结果见表8。

表8  样品分析结果

Table 8  Analytical results of samples（μg/kg）

 注：n=11，ND = Not detectable

由表8可见，采用本方法测定海螺、毛蛤和尖螺等三种贝类样品中5种砷形态的结果，同GB 5009.11-2014测定结果基本上一致。

3  结论

以0.5 mmol/L (NH₄)₂CO₃-甲醇(99:1，V/V；pH= 8.5)为萃取溶液，采用超声波辅助萃取方式，建立了高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（HPLC-ICP-MS）测定贝类中砷胆碱、砷甜菜碱、亚砷酸、砷酸和4-氨基苯胂酸等5种砷形态的分析方法。对超声波辅助萃取温度和时间进行了试验，并对质谱条件RF功率进行了优化，选择最佳RF功率为1450 W，大大提高了5种形态砷的检测灵敏度。考察了该方法的线性关系、检出限和精密度等。实验表明，两水平加标回收率在90.5%～103.5%之间，相对标准偏差在1.6%～4.2%之间，该方法具有操作简便、灵敏度高、精密度好等优点，适用于贝类水产品中5种砷形态的分析。

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 （文章类别：CPST-B）