张 飞¹

摘 要 三七中药材产品经乙腈提取，盐析，采用C18和硅胶固相萃取柱净化后，用气相色谱仪检测38种有机氯、拟除虫菊酯农药残留含量。结果表明：C18和硅胶固相萃取柱净化能够有效除去三七药材中挥发油、有机酸、皂苷等大部分共萃物和干扰组分，获得较好的净化效果；3个不同浓度水平添加回收率在78.6%～120.3%之间，相对标准偏差为0.1%～12.5%；校准曲线线性相关系数均大于0.999。该方法操作简单、快速稳定、除杂效果明显，适用于三七中药材产品中多种农药残留的日常检测工作。

关键词 C18；硅胶；固相萃取；气相色谱；农药残留；三七；中药材

 Determination of 38 Pesticide Residues in Panax Notoginseng with Solid Phase Extraction Column Purification and Gas Chromatography

ZHANG Fei¹

Abstract The Chinese herbal medicinal product of Wenshan panax notoginseng was extracted with acetonitrile, salted out, and purified with C18 and silica gel solid phase extraction column. The residual content of 38 kinds of organochlorine and pyrethroid pesticides was detected by gas chromatography. Purification can effectively remove most co-extracted substances and interfering components such as volatile oils, organic acids, saponins, etc., and achieve a better purification effect; the recovery rate of high and low concentration levels is 78.6%-120.3%, the relative standard deviation is 0.1%-12.5%；The linear correlation coefficients of the calibration are all greater than 0.999. The method is simple to operate, fast and stable, and has obvious impurity removal effects. It is suitable for daily detection of multiple pesticide residues in Chinese medicinal products Wenshan panax notoginseng.

Keywords C18; silica gel; solid phase extraction ; gas chromatography; pesticide residues; panax notoginseng; Chinese herbal medicinal

三七是我国三大名贵中药材之一，享有“北人参南三七”的美誉，是血塞通、云南白药等多种药品的重要原料来源。然而三七作为一种药食同源的产品，其种植、加工过程中难免会造成农药残留污染，给产品质量和消费者身体健康造成影响，同时由于我国中药材农药残留标准与国际标准存在一定差距，欧洲、美国、日本等发达国家严格的技术性贸易措施，使得农药残留污染成为制约三七中药材走向世界的一个重要因素。

目前，三七药材中农药残留含量的测定主要包括样品前处理和仪器分析两大步骤，其中以前处理最为关键，包括目标化合物的提取、净化等内容。由于三七中含有皂苷、有机酸、氨基酸、黄酮、甾醇、糖类、挥发油、色素等复杂的植物化学成分，对有机氯和拟除虫菊酯等农药残留目标化合物的检测产生严重干扰，因此净化成为三七药材农药残留检测的关键。文献记载和报道的净化方法有固相萃取、固相微萃取、QuEChERS、浓硫酸磺化、基质固相萃取净化（MSPD）和碳纳米管等，其中又以弗罗里硅土柱、C18柱、氨基柱、活性炭柱、石墨化碳/氨基复合柱等固相萃取柱的应用最为广泛。除此之外，我国也发布了专门针对三七药材农药残留检测方法的产品标准，如GB/T 19086-2008《地理标志产品 文山三七》^[1]规定了六六六、滴滴涕、五氯硝基苯和甲霜灵的检测方法。2017年中国中药协会发布并实施的《无公害三七药材及饮片农药与重金属及有害元素的最大残留限量》团体标准^[2]，是迄今为止针对性最强、检测项目和限量规定最全、最为广泛的三七药材产品农药残留检测标准，标准采用水和乙腈振荡提取，QuEChERS提取盐分离，Carb/NH₂净化，气相色谱-质谱和液相色谱-质谱法测定三七药材及饮片中206项农药残留。

我国药典（2020版）四部通则农药残留测定方法^[3]中，关于有机氯和拟除虫菊酯农药残留的测定，分别采用浓硫酸、凝胶渗透色谱（GPC）配合弗罗里硅土柱、混合小柱（无水硫酸钠、弗罗里硅土、微晶纤维素和氧化铝）以及分散固相萃取的方式净化，其中分散固相萃取使用了硅胶等吸附材料，美国药典^[4]则直接使用硅胶固相萃取柱净化。除上述药典方法之外，未见硅胶材料或其柱产品用于三七农药残留检测的文献报道。最常用的有机氯和拟除虫菊酯净化柱为弗罗里硅土柱，其与硅胶柱虽同属于正相柱，结构和吸附原理相似，但硅胶较弗罗里硅土极性更大，吸附性能更强，更适宜极性杂质的综合吸附和有机氯、拟除虫菊酯等弱极性目标化合物的洗脱。

本文以C18和硅胶固相萃取柱作为三七药材产品提取液净化的手段，操作简单、快速有效，对目标物和共萃物的分离净化效果较好，验证方法的线性、回收率、检出限和精密度等指标获得满意结果，为三七药材产品的农药残留日常检测和快速筛查提供参考。

1  实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

美国安捷伦公司7890A气相色谱仪，配电子捕获检测器（ECD）；瑞士梅特勒公司METTLER AE240万分之一分析天平；德国IKA公司IKA-WERKE HS501 digital KS501数显震荡摇床；德国Sigma台式高速冷冻离心机3K15；德国IKA公司IKA MS3涡旋混合器；瑞士Buchi公司R-215型旋转蒸发仪；大德公司DF-45中药材连续投料粉碎机器；临海谭氏真空设备有限公司SHZ-IIIB循环水式多用真空泵。

38种有机氯和拟除虫菊酯农药试剂购于农业农村部环境保护监测所，浓度100μg/mL，正己烷介质；乙腈，色谱纯，默克公司；无水硫酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，用前在 650℃灼烧4 h，贮存于干燥器中备用；氯化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Supelclean ENVI-18固相萃取小柱，2 g/12 mL，Supelco公司；DiscoverY DSC-Si SPE小柱，500 mg/6 mL，Supelco公司。

三七药材样品三七根（15～60头不等），购于文山三七国际交易市场。

1.2 实验方法 

1.2.1 农药标准溶液的配制

标准中间液，根据每种农药在仪器上的响应和分离情况将混标溶液分为2组，分组情况见图1、图2，除氯菊酯、氯氰菊酯两种外，分别将其余28种有机氯农药和8种拟除虫菊酯农药, 用正己烷稀释至20μg/mL，取50μL上述溶液与氯菊酯、氯氰菊酯母液（100μg/mL）配制成混合标准溶液，其中氯菊酯、氯氰菊酯混标浓度为5μg/mL，其余28种有机氯农药和8种拟除虫菊酯混标浓度为1μg/mL。

图1 第I组有机氯、菊酯混合标准品色谱图

Fig.1 The chromatogram of the first group of mixed standards organochlorine and pyrethroid

图2 第II组有机氯、菊酯混合标准品色谱图

Fig.2 The chromatogram of the second group of mixed standards organochlorine and pyrethroid

标准系列溶液，分别取标准中间液50μL、100μL、200μL用正己烷稀释至1 mL，得到标准溶液系列I质量浓度分别为C 0.05μg/mL、D 0.1μg/mL、E 0.2μg/mL,再取100μL D、E用正己烷稀释至1 mL，得到标准溶液系列II质量浓度分别为A 0.01μg/mL、B 0.02μg/mL，标准溶液系列I、II按照浓度从低到高分别为A 0.01μg/mL、B 0.02μg/mL、C 0.05μg/mL、D 0.1μg/mL、E 0.2μg/mL， 以此绘制标准工作曲线。上述农药标准溶液均贮存于-18±4℃冰箱中。

1.2.2 样品制备

三七样品采用四分法缩分，取约100 g样品，用粉碎机粉碎，过100目标准检验筛，常温干燥器中保存备用。

1.2.3 目标化合物提取

准确称取粉碎好的样品2.0 g(精确至0.0001 g)于80 mL离心管中，加纯水10 mL涡旋混匀，浸泡30 min，再加入乙腈50 mL振荡提取30 min，加入3～5 g 氯化钠后剧烈振摇1 min，然后在6000 r/min下离心5 min，取上清液10 mL待净化。

1.2.4 共萃物分离净化

将Supelclean Envi -18柱放入固定架上，将上述提取液转移至固相萃取小柱上，加样前先用10 mL乙腈预洗，下接平底烧瓶，并用15 mL乙腈洗涤小柱， 将收集的提取液和洗涤液在45℃水浴中旋转浓缩至近干，2 mL正己烷复溶，待下一步净化。

将DSC-Si SPE小柱放入固定架上，小柱中加入1cm高的无水硫酸钠层，用5 mL二氯甲烷-正己烷（1:9）、5 mL 正己烷溶液预洗，弃去淋洗液，待淋洗液面高于无水硫酸钠层1～2 mm时，加入2 mL正己烷提取液，用20 mL二氯甲烷-正己烷（1:9）混合溶液洗脱，收集洗脱液，并于45℃水浴中旋蒸转浓缩至近干，加入5 mL正己烷进行溶剂置换，重复1～2次，最后用正己烷定容至2 mL，用于气相色谱仪测定。

1.2.5 气相色谱条件

色谱柱 ：安捷伦HP-5色谱柱，规格 ：30 m×0.25 mm×0.25μm；柱温箱升温程序：60℃保持1 min，以20℃ /min 升温至180℃，保持1 min，以5℃ /min 升温至280℃，保持6 min；进样口温度：280℃；检测器温度：300℃ ；载气：高纯N₂（纯度>99.999%）；柱流速：2 mL/min ；不分流进样，进样体积1μL。取峰面积外标法定量。

2  结果与讨论

2.1 净化效果比较

理论研究表明，C18 硅胶键合柱能有效去除油脂、糖类、甾醇、维生素、部分色素等干扰物或难挥发组分^[5]。硅胶和弗罗里硅土材料虽具有极为相似的吸附表面，但前者表现出更强的极性吸附作用^[6]，对于三七提取物中皂苷等极性、弱极性物质的综合净化效果明显。为了考察样品净化方式对三七药材产品的净化效果，笔者选取经确认不含目标化合物残留的样品（空白样品），按照样品前处理方式，其他条件保持不变的前提下，在1.2.3获得的提取液中，取10 mL上层清液旋蒸浓缩至近干，正己烷复溶，另取10 mL上清液按1.2.4净化方式处理后浓缩，并用正己烷定容，上述二者进气相色谱仪分析，结果见图3。从二者的色谱图对比来看，经C18、硅胶固相萃取柱净化后，样品基质杂峰的数量明显减少，部分杂峰响应信号大幅度降低，净化除去多数共萃物和干扰杂质，为实现目标物与共萃物有效分离、最大程度降低基质效应创造良好的条件。

图3 三七药材空白样品净化前后对比

Fig.3 Comparison of blank samples of Panax notoginseng before and after purification

2.2 标准曲线和线性相关性

结合2.3中方法的检出限、定量限以及三七药材中农药残留化合物的MRL值等确定测试覆盖的浓度范围，在0.01～1.5μg/mL区间（包含端点，氯菊酯、氯氰菊酯配制范围0.1～5μg/mL）配制9个点的标准溶液系列，每个校正点重复测试2次，要求重复测试偏差不超过20%，线性回归方程的相关系数不低于0.99，结果表明38种有机氯和拟除虫菊酯目标化合物在覆盖的浓度范围内均呈良好的线性。依照1.2.1农药标准溶液的配制方法，取5个不同质量浓度的混合标准溶液，按1.2.5气相色谱条件进样，进样质量浓度依次为0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL，以质量浓度（X）对色谱峰面积（Y）作图，并进行线性回归分析。各农药的线性范围、校正方程、相关系数结果见表1。

2.3 方法的回收率、检出限、定量限和重复性

选择不含目标化合物的三七药材空白样品，分别加入一定量的混合标准品溶液，如选取定量限（LOQ）的1倍、2倍和3倍的3个添加水平，即样品空白添加农药质量浓度分别为0.01 mg /kg、0.02 mg /kg和0.1 mg /kg，每个质量浓度的样品平行测试7次，按以上实验方法处理并测定，计算相应回收率及RSD值，结果表明：3个浓度水平添加回收率在78.6%～120.3%之间，相对标准偏差（RSD）在0.1%～12.5%之间，回收率和重复性均达到质量控制要求。利用校准方程的参数评估检出限^[7]，按照公式LOD = 3×S / b, LOD = 2× LOD进行计算，其中S为相对标准偏差，b为校正曲线斜率。方法的线性、回收率（正确度）、检出限、定量限和精密度（重复性）结果见表1。

图4 三七药材样品空白加标色谱图（第I组） 

Fig.4 The chromatogram of blank added standards Panax notoginseng sample (Group I)

图5 三七药材样品空白加标色谱图（第II组） 

Fig.5 The chromatogram of blank added standards Panax notoginseng sample(Group II)

表1  38种有机氯和菊酯农药化合物的线性、LOD、LOQ、回收率及相对标准偏差结果

Table 1  ResμLts of linearity, LOD, LOQ, recovery rate and relative standard deviation of 38 organochlorine and pyrethroid pesticide

3  结论

三七药材同时作为一种植物源性食品，其植物化学组成复杂，通过水浸泡、乙腈溶剂提取三七药材中的38种有机氯和拟除虫菊酯农药残留目标化合物，经C18、硅胶固相萃取柱净化，配合弱极性的二氯甲烷-正己烷混合溶液洗脱，能够有效除去挥发油、有机酸、皂苷等大部分共萃物和干扰组分，获得满意的净化效果，该方法不仅操作简单、快速稳定，且方法线性相关性、回收率、精密度和检出限等特性参数满足农药残留检测质量控制要求，不失为一种测定三七药材中有机氯和拟除虫菊酯农药残留的有效方法。

我们在测试过程中还发现，三氯杀螨醇、三唑酮等部分农药残留目标物表现出极强的基质增强效应，使用该方法不能有效去除共萃物的干扰，在多残留检测中还需进一步改进或研究新的净化方法，以获得准确的测试结果。

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第一作者：张飞（1986—），男，汉族，助理工程师，从事食品及农产品检验工作，E-mail：511272185@qq.com

1.天保海关  云南文山  663099

1. TianBao Customs, Wenshan Yunnan  663099

参考文献

[1] 原国家质量监督检验检疫总局. GB/T 19086-2008, 地理标志产品 文山三七[S].

[2] 中国中药协会.T/CATCM 003-2017, 无公害三七药材及饮片农药与重金属及有害元素的最大残留限量[S].

[3] 国家药典委员会. 中国药典（2020年版）通则2341农药残留量测定法[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 239-279.

[4] 美国国家药典委员会.美国药典（第34修订版）-国家处方集（第29版）[M]. 北京：化学工业出版社, 2013:第一卷.

[5] 邵林, 李福敏, 孙钢,等.气相色谱-三重四极杆串联质谱结合QuEChERS测定三七中有机磷农药残留[J]. 分析试验室. 2020, 39(4): 459-464.

[6] 陈小华, 汪群杰.固相萃取技术与应用[M]. 北京:科学出版社, 2010: 62-64.

[7] 原国家质量监督检验检疫总局. GB/T 27417-2017, 合格评定 化学分析方法确认和验证指南[S]. 北京:中国标准出版社, 2017.

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