杨永超1 杜 宇1 何 成1 于艳军1 韩 伟1 李宁涛1 熊中强1 王利兵1*

摘 要 建立了测定化妆品中对甲苯磺酸异丙酯（IPTS）含量的高效液相—二极管阵列检测器（HPLC-DAD）方法。方法采用C18（250 mm×4.6 mm，5μm）反相柱；流动相为乙腈—20 mM乙酸铵水溶液（pH=3），等度洗脱，流速1.0 mL/min；柱温为35℃；采集波长为227 nm。结果表明在0.5～50μg/mL浓度范围内，IPTS的浓度与峰面积呈现良好的线性关系，线性相关系数r=0.9996，检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为2.5μg/mg、5.0μg/mg。方法在低、中、高三浓度水平的添加回收率为95.8%～108.1%，RSD在0.72%～2.27%范围内。方法用于市售化妆品中IPTS的检测，1个样品检出为阳性，并用紫外吸收光谱和气质联用仪（GC-MS）进行确证，结果为假阳性。试验证明该方法简便准确，检测限较低，满足实际检测需要，可用于化妆品中IPTS的检测。

关键词 化妆品；对甲苯磺酸异丙酯；高效液相色谱；GC-MS确证

 Determination of Isopropyl P-toluenesulfonate in Cosmetics by High-performance Liquid Chromatography

YANG Yong-Chao1  DU Yu1  HE Cheng1  YU Yan-Jun1

HAN Wei1  LI Ning-Tao1 XIONG Zhong-Qiang1  WANG Li-Bing1^*

Abstract A sensitive and rapid method was developed for the determination of isopropyl p-toluenesulfonate (IPTS) in cosmetics by high-performance liquid chromatography with a diode array detector (HPLC-DAD). The method uses a C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm) reversed phase column; the mobile phase was acetonitrile-20 mM ammonium acetate aqueous solution (pH=3), isocratic elution, flow rate 1.0 mL/min; column temperature was 35℃; The collection wavelength is 227 nm. The results show that in the concentration range of 0.5-50μg/mL, the concentration of IPTS has a good linear relationship with the peak area; the linear correlation coefficient r=0.999 6, the limit of detection and quantification (LOD and LOQ) were 2.5μg/mg and 5.0μg/mg, respectively. The recovery rate at low, medium and high levels is 95.8% -108.1% with relative standard deviations from 0.72% to 2.27%. Then the simple protocol was applied to the determination of IPTS in cosmetics. One positive sample was detected and confirmed by UV absorption spectrum and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), indicating a false positive result. Results showed that the method could serve for cosmetics supervision in determination of the toxic IPTS.

Keywords cosmetics; isopropyl p-toluenesulfonate; high-performance liquid chromatography; confirmed by GC-MS

棕榈酸异丙酯（IPP）和肉豆蔻酸异丙酯（IPM）是一种低黏度亲油类的非离子型表面活性剂，具有良好的铺展性、润滑性、滋润度、保湿性、透气性以及极佳的皮肤相容性，对皮肤和黏膜的刺激性很低，可使皮肤光滑、柔润、富有弹性。因而广泛应用于化妆品中，如护肤霜、发油、毛发调理剂等，特别是婴幼儿产品和高档化妆品中^[1-3]. 目前两种重要化合物的合成途径主要是相应的棕榈酸、肉豆蔻酸分别与异丙酯在催化剂——对甲苯磺酸作用下酯化得到，在特定情况下，对甲苯磺酸与异丙酯也会发生酯化反应，从而生成副产物对甲苯磺酸异丙酯（isopropyl p-toluenesulphonic acid ester，IPTS）^[4]。

研究表明，对苯磺酸酯类是一种潜在的毒性物质^[5-7]，这些物质可与DNA发生烷基化反应^[8-9]从而诱发癌症。截至目前，IPTS在世界范围内尚未列入化妆品的“禁限用”组分中。但是，欧洲药品管理局（EMA）和美国食药局对这类毒性物质已经起草了相应的指南，其毒理学关注阈值为1.5μg/人/天^[10-11]。因此，不久的将来，IPTS极有可能被列入化妆品有毒有害物质的监管目录中。

随着化妆品产业的发展，人们接触化妆品的概率和频率都在急速上涨。IPP和IPM的存在，加快、加深了皮肤对IPTS的吸收，进一步加大了消费者使用化妆品时的安全风险。因此，对化妆品中该毒性物质浓度水平的控制至关重要。

目前，对于这类物质的检测，主要有气质联用（GC-MS）技术^[12]、高效液相色谱^[13]和液相色谱串联质谱技术^[14]。现有的报道几乎都是对药物中IPTS的测定，而对于化妆品则鲜有报道。因此，本文建立一种高效液相色谱（HPLC）方法，联合GC-MS确证，试验结果表明该方法可以简便快速测定化妆品中IPTS的含量。

1  试验部分

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱仪（美国ThermoFisher，型号： Ultimate 3000SD），配置二极管阵列检测器（DAD）；气相色谱—质谱联用仪（美国布鲁克，型号：SCION-TQ）；紫外可见分光光度计（美国Agilent，型号：G9822A cary300）。

对甲苯磺酸异丙酯标准品（上海安谱实验科技有限公司，货号：CDDM-I873800-1 g，纯度：97.0%）；乙腈（色谱纯）；乙酸铵（优级纯）；超纯水。

1.2 标准储备液配制 

精密称取对甲苯磺酸异丙酯标准品约10.0 mg（精确至0.1 mg），置10.0 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液（现配现用）。

1.3 样品制备 

称取0.1 g（精确至0.001 g）化妆品样品置于10 mL带盖带刻度样品管中，加入5 mL乙腈，超声提取10 min，10000 r/min离心2 min，取上层清液经0.45μm滤膜过滤后上机测试。

1.4 色谱条件 

色谱柱为ThermoFisher Acclaim^TM 120-C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm)。流动相为乙腈-20 mmol/L乙酸铵水溶液(50:50，乙酸铵水溶液提前用乙酸调至pH=3)，流速为1.0 mL/min，检测波长为227 nm，进样量5μL。

1.5 GC-MS确证条件

色谱条件：色谱柱为毛细管柱（HP-5 30 m × 0.25 mm ×0.25μm）。氦气（纯度99.99%）为载气，流速1.0 mL/min。程序升温：起始温度为100℃，维持1 min，然后升至250℃，保持10 min，升温速率为10℃/min。进样口温度250℃，分流比10:1，进样体积1.0μL，溶剂延迟4 min。

质谱条件：EI源（电子轰击电离源），电子能量为80 eV，离子源温度为250℃。扫描方式为选择离子扫描（SIM），选择离子（m/z：91、172、214）。

2  结果与讨论

2.1 波长选择

对IPTS溶液进行全波长（190-800nm）扫描。对甲苯磺酸异丙酯的紫外吸收图谱在227 nm处有最大吸收，因此，本实验选择227 nm作为检测波长。

2.2 稳定性试验

试验考察了IPTS在不同溶液A和B中的稳定性。A为50%乙腈/水，B标准溶液的溶剂为乙腈，分别于室温放置12 h，期间每小时测量A和B标准溶液的浓度，以研究标准溶液的稳定性，测试结果如图1所示。图（a），A标准溶液，随着时间的推移IPTS的峰面积（R_t=9.48）在逐渐减小，从其柱形图中看出，12 h后，IPTS浓度仅剩60%左右；而图（b），B标准溶液，12小时内，IPTS的浓度基本无变化，表明IPTS在乙腈中的稳定性良好，试验说明，水相增加，IPTS稳定性降低，因此标准溶液配制选择乙腈做溶剂，最好现用现配。

2.3 色谱柱的选择

试验考察了Acclaim 120-C18和ZORBAX Eclipse XDB-CN（规格都为250 mm×4.6 mm，5μm）反相柱分离效果。结果表明，二者都能很好的分离出IPTS，都可满足分析需求。但是后者出峰时间比前者更早一些，易被杂质峰干扰，若通过改变流动相比例，调整合适的出峰时间，需要加入更多的水相，会降低IPTS的稳定性。故选用Acclaim 120-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）为本试验的色谱柱。

2.4 流动相的选择

试验考察了90:10（V/V），70:30（V/V）和50:50（V/V）水-乙腈流动相对分离效果的影响。结果表明，流动相为50:50（V/V）水-乙腈时，IPTS峰形尖锐且对称，并且出峰时间大于9 min，可有效避免极性较大的杂质峰的干扰（一般出峰时间小于5 min）。然而50:50（V/V）水-乙腈流动相，并不适用于所有类型的化妆品，对于部分乳液，精华乳等，会出现干扰峰。因此，水相中加入20 mmol/L的乙酸铵（乙酸铵水溶液提前用乙酸调至pH=3），干扰峰消失，这可能是由于乙酸铵与样品中的杂质相互作用，起到了消除基质干扰的效果^[15-17]。故选用20 mmol 乙酸铵（pH值=3）水溶液-乙腈（V/V =50:50）为本实验的流动相。

2.5 提取剂的选择

试验考察了乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷对化妆品中IPTS的提取效果，见图2（a）。结果表明，正己烷效率最低，乙腈，甲醇和乙酸乙酯的提取效率相差不大，乙腈略高，且杂质干扰最少，故选用乙腈为萃取溶剂。

2.6 提取时间的优化

以乙腈作为萃取剂，考察了超声提取时间（5 min-20 min）对提取效果的影响，结果如图2（b）所示。提取时间为10 min时，提取几近完全，10 min后提取效率基本保持一致，方法最终选择超声提取时间为10 min。

3  方法学验证

3.1 线性范围

精密量取1.2标准储备液0.5 mL、0.25 mL、0.1 mL、0.05 mL、0.01 mL，分别置10 mL 量瓶中，加乙腈溶剂稀释至刻度，摇匀，得浓度为50.0μg/mL、25.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、1.0μg/mL溶液，然后用1.0μg/mL标准溶液稀释得到0.5μg/mL溶液，最终得到线性系列溶液50.0μg/mL、25.0μg/mL、10.0μg/mL、5.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL（共计6个浓度点）。上机测试，记录对甲苯磺酸异丙酯峰面积。以浓度(μg/mL)为横坐标x，主峰面积为纵坐标y，进行线性回归。回归曲线为: y = 0.0547x-0.016，r= 0.9996。表明，IPTS在0.5～50 μg/mL范围内线性良好。

3.2 精密度试验

以浓度为20μg/mL的标准溶液为测试点，连续进样6次，记录对甲苯磺酸异丙酯峰面积，计算相应的相对标准偏差。结果显示RSD为1.96%，表明仪器精密度良好。

3.3 检测限、定量限和检出浓度、最低定量浓度

采用逐级稀释标准溶液方法进样，信噪比（S/N）为3时的样品浓度即为检测限浓度；S/N为10时的样品浓度即为定量限浓度。按此方法，进样量为5μL时，得出的检测限为（LOD）0.05μg/mL，定量限（LOQ）为0.1μg/mL。当取样量为0.1 g，5 mL乙腈提取时，相应的检出浓度为2.5μg/g，最低定量浓度为5.0μg/g。另外，方法通过增大样品的进样量，可降低检测限和定量限。

3.4 回收率

取3种空白化妆品，润肤水，乳状、膏状，每种化妆品分别添加5μg、10μg、50μg标准品，每个浓度平行6份，然后按照“1.3”项下的方法制备样品上机测试，计算回收率，结果见表1。3种化妆品的三水平添加回收率在95.8%~108.1%之间，表明各种化妆品样品的加标回收试验结果良好。相应的测定结果RSD均小于5%，该方法准确度和精密度良好。

图 2 （a）溶剂和（b）提取时间对提取效率的影响

Fig.2  The effect of (a) solvents and (b) extraction time on extraction efficiencies

表1  三种化妆品回收率实验结果

Table 1  Recovery rate test results of 3 kinds of cosmetics

3.5 GC-MS确证

试验过程中，由于化妆品成分复杂，对HPLC检测结果容易造成基质干扰，出现假阳性的现象。除了进行后台目标物和检出物的UV-vis光谱对照方法外，本文采用GC-MS方法进行进一步确证，以保证结果的准确性。按照上文确证条件，对加标的阴性化妆品样品进行GC-MS确证，图谱见图3。

图3  GC-MS确证

Fig.3  Confirmation by GC-MS

3.6 样品检测

3.6.1 实际样品测试

取市售8种化妆品，按文中方法制备样品，上机测试，计算化妆品中对IPTS的含量。详细结果见表2。结果显示，4#样品检出IPTS，浓度为42μg/g，其他均未检出。

表2  实际样品检测结果

Table 2  Test results of samples on sale

3.6.2 阳性样品确证

HPLC后台提取4#样品和浓度相似的标准品（1μg/mL）的紫外吸收图谱。通过比对可知，二者的紫外图谱并不一样，证明4#样品为假阳性。

同时对4#样品提取液进行GC-MS确证，结果进一步表明，4#样品确实为假阳性。后续工作将会对该检出物质进行分析。

4  讨论

本文建立了高效液相色谱法测定化妆品中的毒性物质—对甲苯磺酸异丙酯（IPTS）的方法。该方法线性与精密度良好，方法准确、可靠、操作便捷。方法用于市售化妆品中IPTS的检测，检测结果表明：8个样品中仅一个检出目标物，通过UV-Vis图谱比对及GC-MS确证，表明样品为假阳性。方法的建立健全了化妆品检测技术库，可为化妆品安全监管提供技术支持。

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（文章类别：CPST-C）