姚志敏1 林 童1 陈秀红2* 苏姗姗1 白成莲2 凤晓博1 唐 磊3

摘 要 建立了超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱（UPLC-MS/MS) 快速筛查除虫菊素类农药非法添加隐性成分尼古丁含量。样品经乙酸乙酯+环己烷（1+1）溶液提取，用凝胶色谱系统GPC净化，采用CAPCELL PAK C18 IF2 色谱柱( 2.1 mm×100 mm，2μm)分离，0.1%甲酸（含2 mmoL乙酸铵）水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱。采用电喷雾离子源正离子（ESI +）模式和多反应检测（MRM）模式进行质谱分析。尼古丁在0.2～50 ng/mL范围内线性关系良好（r2=0.99966）；定量限（LOQ）为0.5μg/kg，回收率为70.8 %～90.5 %，相对标准偏差（RSD）为4.1 %～ 5.1%。该方法简单、准确、快速，适用于农药中非法添加隐性成分尼古丁的定性筛查和定量分析。

关键词 超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱；除虫菊素类农药；隐性成分；尼古丁；快速筛查

 Rapid Screening of the Hidden Ingredient Nicotine in Pyrethrins Pesticides by Ultra-Performance Liquid Chromatography  -  Mass Spectrometry Mass Spectrometry

YAO Zhi-Min1  LIN Tong1  CHEN Xiu-Hong2*

SU Shan-Shan1  BAI Cheng-Lian2  FENG Xiao-Bo1  TANG Lei3

Abstract An ultra-performance liquid chromatography - mass spectrometry mass spectrometry（UPLC-MS/MS) was developed for the rapid screening and analysis of nicotine in pyrethrins pesticides as illegal addition of the hidden ingredient. The samples were extracted by solution(1:1) of ethyl acetate and cyclohexane and purified by gel chromatography, separated on a CAPCELL PAK C18 IF2( 2.1mm×100mm，2μm) column using a binary solvent system composed of 0.1% formic acid (containing 2 mmoL ammonium acetate) aqueous solutionand acetonitrile solution by gradient elution．The mass spectrometric acquisition was carried out by means of electrospray ionization in positive mode (ESI +) with a multiple-reaction monitoring (MRM) method. The result showed a good linear relationship for nicotine in range of 0.2～50 ng/ml（r2=0.99966）. The limits of quantitation ( LOQ) were in range of 0.5μg/kg. The recoveries ranged from 70.8% ~90.5% with relative standard deviations( RSD) of 4.1% ~ 5.1%. The method was simple, sensitive and accurate, which was suitable for the rapid screening and confirmation of nicotine in pyrethrins pesticides as illegal addition of hidden ingredient.

Keywords Ultra-performance liquid chromatography – mass spectrometry mass spectrometry; pyrethrins pesticides; hidden ingredient; nicotine; rapid screening

农药作为农业生产中必不可少的投入品已经被广泛应用，在保障农业增产增收及控制病虫鼠害方面发挥了重要作用^[1]，但近年来，一些不法商家通过违法添加隐性成分来增加药性，增强产品竞争力。在农药中添加隐性成分会对农业生产和农产品质量安全造成严重的影响。产品标签上不会标出隐性成分，农民不能采取相应的防护措施以保证施药安全。另外，一旦发生人畜中毒事故，无法做到对症下药，从而延误救治时间造成严重后果^[2-5]。

除虫菊素是一种天然植物源杀虫剂，具有高效、低毒、低残留、不污染环境及害虫不易产生抗药性等优点，被广泛使用。除虫菊素类农药通常用于蔬菜水果中，可有效防治害虫^[6-7]，添加尼古丁能增加药效，显著提高防治效果。尼古丁又名烟碱，对生物体的中枢神经和交感神经都有一定的毒副作用，能够增加血液中的肾上腺素，使人心跳加快、血压上升、呼吸急促等，可促进血小板凝结，造成心血管阻塞、中风等急慢性疾病^[8-12]。

目前尚未有除虫菊素类农药中尼古丁含量检测的报道^[13]，本文采用凝胶色谱系统GPC净化，使用超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱建立了定性定量方法，对试样中的尼古丁进行分离和测定，得到了良好的结果。该方法操作简便、准确度高、重现性好，能快速定性定量分析除虫菊素类农药中的隐性成分尼古丁，为农药中非法添加物的监管提供了技术支撑。

1  实验部分

1.1 仪器与试剂

AB SCIEX QTRAP 5500 超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱（美国AB Sciex公司）；超声波清洗机（KQ-500DB，昆山市超声仪器有限公司）；ME1002型十万分之一电子天平（梅特勒-托利多，瑞士）；QL-861涡旋混匀仪（海门市麒麟医用仪器厂）；超高速冷冻离心机（CP100NX，日本日立公司）；PREPLINC GPC凝胶色谱系统（美国J2 SCIENTIFIC公司）；R-210旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司）。

甲醇、乙腈均为色谱纯（默克公司，美国）；甲酸为色谱纯（西格玛公司，美国）；乙酸乙酯、环己烷为色谱纯（天津大茂公司，中国）；水为超纯水（美国Milli-Q，SP Regent Water system）；尼古丁标准品（美国西格玛公司，纯度为98.0 %）。

1.2 标准溶液的配制 

准确称取尼古丁标准品，用乙腈溶解，配制成100 μg/mL的标准储备液，密封，4℃保存。精密吸取一定量的标准储备液，用流动相配制标准工作溶液。

1.3 仪器条件

1.3.1 GPC净化条件

凝胶色谱系统：PREPLINC GPC（J2），GPC色谱柱规格：400 mm × 25 mm（内经），色谱柱填料：Bio-Beads S-X3(38～75μm)，流动相：乙酸乙酯-环己烷（1∶1，体积比），流速：5 mL/min，收集时间9～17 min。

1.3.2 UPLC-MS/MS分析条件

色谱条件：CAPCELL PAK C18 IF2 色谱柱( 2.1 mm × 100 mm，2μm)，流动相为乙腈（A）- 0.1%甲酸（含2 mmoL乙酸铵）水溶液（B）。梯度洗脱：0～1 min，10% A；1～2.5 min， 10%～45% A；2.5～3 min，45%～90% A；3～4 min，90% A；4～4.1 min，90%～10 % A；4.1～5 min，10% A；流速为 0. 3 mL/min；柱温35℃；进样量5μL。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI），扫描模式：正离子，辅助气55 arb；喷雾电压5000 V（+）；离子源温度600℃；扫描模式为多反应检测（MRM）模式。

1.4 样品的前处理

1.4.1 提取

取农药试样5 g（精确至0.01 g）置于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加入乙酸乙酯+环己烷（1+1）溶液15 mL，涡旋混匀1 min，超声提取15 min，离心5 min（8000 r/min）,取15 mL上清液，待净化。

1.4.2 净化

取上述提取液10 mL至GPC样品管中，按照1.3.1的条件进行GPC净化，收集洗脱并转移到100 mL鸡心瓶中，并在40℃水浴中旋转浓缩至约0.5 mL。将浓缩液用氮气缓慢吹干，加入2 mL乙腈涡旋混匀并超声溶解后转移至5 mL刻度离心管中，并用2 mL乙腈洗涤鸡心瓶，洗液合并至刻度离心管中，用乙腈定容至5 mL混匀，经0.22μm有机相微孔滤膜过滤后进行液相色谱-串联质谱仪测定。

2  结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

试验采用电喷雾离子化源(ESI)，定量分析采用多反应离子监测(MRM) ，2对离子对尼古丁进行分析, 为了获得最佳的质谱条件以保证定性定量的准确性，对去簇电压(DP)和碰撞能(CE)等质谱参数进行了优化。尼古丁的保留时间和质谱信息见表1。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

试验考察了CAPCELL PAK C₁₈ IF2 色谱柱( 2.1 mm×100 mm，2μm)和Thermo Scientific Hypersil GOLD aQ色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.9μm）对待测物的分析效果，在相同流动相条件下，前者的分离效果和峰型较优于后者，峰面积重复性较好。

2.2.2 流动相的选择

试验设计并考察了有机相甲醇、乙腈及水相水、0.1%甲酸水、2 mmoL乙酸铵水溶液的不同组合为流动相对定性定量结果的影响。结果表明，有机相采用乙腈的分离结果优于甲醇，而且当流动相中加入0. 1%甲酸后，可以提高待测物质的信号强度，另外当流动相中加入0.2 mmoL乙酸铵后，色谱峰峰型较好，故采用乙腈- 0.1%甲酸（含2 mmoL乙酸铵）水溶液作为流动相。经反复优化，确定了“1.3.2”所述的流动相梯度洗脱条件，该目标物可在0.65 min 内出峰且峰形良好，标准溶液色谱图见图1。

2.3 前处理方法的优化

试验考察了不同SPE小柱及GPC净化方法，发现用乙酸乙酯-环己烷提取试样中的尼古丁，经凝胶色谱净化系统净化较合适，该方法既能充分提取目标物且杂质较少，提高了前处理效率；GPC净化方法操作简便快捷，使用耗材试剂较少，适合快速筛查大批量农药中尼古丁成分。

2.4 方法学验证

2.4.1 方法的线性范围与检出限 

用不含待测物的空白基质溶液配制0.2、0.5、1、5、10、20、50 ng/mL一系列标准样品，按前处理方法处理后上机测定。以待测物特征离子的色谱峰面积为纵坐标y，以待测物的浓度为横坐标x，绘制基质加标工作曲线，可以得到良好线性关系，相关系数r大于0.999，在空白样品中添加低浓度待测物，3倍信噪比时对应的浓度为该方法的检出限，10倍信噪比时对应浓度为该方法的定量限。尼古丁的线性范围等如表2 所示，回归曲线见图2。表1  尼古丁的保留时间和质谱信息

Table 1  Retention time and MS information of nicotine

      注：*为定量离子

图1  标准品溶液的色谱图

Fig.1  Chromatogram of standard solution

图2  尼古丁回归曲线图

Fig.2  Nicotine regression curve

表2  尼古丁的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Table 2  Linear range, linear equation, correlation coefficient, limit of detection and limit of quantification of nicotine

2.4.2 回收率与精密度

选取除虫菊素乳油剂的空白样品，分别添加1 倍定量限、2 倍定量限和10 倍定量限浓度的标准溶液，每个添加水平6 个平行，样品按“1.4”方法进行前处理，计算其回收率和相对标准偏差(RSD) ，结果见表3。测定的回收率为70.8%～90.5%，RSD 为4.1%～ 5.1%。该方法具有较好的回收率和重复性，可满足乳油剂除虫菊素农药中隐性成分尼古丁的日常监测要求。

表3  尼古丁回收率和相对标准偏差

Table 3  Nicotine recovery rate and relative standard deviation

2.4.3 实际样品的检测

采用本试验建立的方法对市售的25批次除虫菊素类农药进行筛查测定。结果发现有2批次农药中尼古丁阳性检出，含量分别为80.2μg/kg、241.1μg/kg。

3  结论

本试验利用乙酸乙酯+环己烷（1+1）溶液提取，用凝胶色谱系统GPC净化，超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱分析，建立了快速定性筛查和定量分析乳油剂除虫菊素农药中隐性成分尼古丁的方法。凝胶色谱系统GPC可以有效去除乳油剂除虫菊素农药基质中的油性高分子聚合物杂质，净化步骤简单、方便操作，且凝胶色谱柱可重复使用以节约检测成本，提高了检测效率。超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱能有效分离分析复杂有机混合物^[14] ，显著提高了尼古丁目标化合物的定性和定量结果的准确性，本方法快速简便、前处理成本低廉、分析效率高，适用于除虫菊素类农药中隐性成分尼古丁的快速筛查测定。

【该文经CNKI学术不端文献检测系统检测，总文字复制比为8.4%】。

参考文献

[1]郭艳,崔方让. 气相色谱法在农产品农药残留检测中的应用[J]. 现代农业科技. 2021 (03): 229-230.

[2]张寒, 黄晓华, 徐永,等.农药隐性成分现状分析及对策[J].农药科学与管理2017 (05): 6-10.

[3]汪志威, 周思齐, 李非里,等.农业投入品中隐性成分筛查方法及应用[J].浙江农业科学. 2019(06): 974-981.

[4]李俊, 蔡滔, 周雪丽,等.气相色谱-三重四级杆质谱法同时测定农药中32种隐性添加成分[J].食品安全质量检测学报2018 (13): 3219-3225.

[5]乔成奎, 黄玉南, 罗静, 等. HPLC-MS/MS法检测农药产品中30种隐性成分[J].农药 2015(05): 340-342+345.

[6]王迪轩.有机蔬菜常备药剂——除虫菊素[J]科学种养2015 (12): 34.

[7]黄兴萍.除虫菊酯类农药中毒患者的抢救与护理[J].系统医学. 2019 (06): 186-188.

[8]朱欣潮, 陈欢, 胡香杰,等. 成瘾剂量下烟碱对大鼠的毒性损伤[J]. 烟草科技. 2017(07): 62-68.

[9]张豪, 李先红, 姚允怡, 等. 尼古丁代谢相关细胞色素P450家族及其与帕金森病发病关系的研究进展[J].山东医药. 2019 (21): 90-93.

[10]朱成云, 李骏, 钟卫鸿. 微生物代谢尼古丁的研究进展及应用[J]. 轻工科技2018 (12): 6-8.

[11]林涛, 魏茂琼, 余积东, 等. QuEChERS-超高效液相色谱-三重四极杆质谱测定野生食用菌中尼古丁[J].色谱. 2019 (05): 512-517.

[12]王康, 张敬军, 尼古丁的负性功效及作用机制研究进展[J]. 中华脑科疾病与康复杂志.2015 (04): 278-282.

[13]张佳杰, 孟子晖, 薛敏, 等. 烟碱样品前处理及分析方法研究进展[J]. 色谱2018(11): 1081-1087.

[14]陈秀红, 王春英, 赵光跃,等. UPLC-MS/MS筛查卤制品中罂粟壳生物碱及工业染料 [J] .《食品科技》2020 (4): 296-301.

（文章类别：CPST-C）