樊彦莉1 邱伟科1 袁辰刚1 时逸吟1 杨惠琴1 杨捷琳1

摘 要 阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii，C. sakazakii）是克罗诺杆菌属（原为阪崎肠杆菌）代表种，是婴幼儿配方奶粉中常见分离的主要致病菌。本项目利用上海海关动植物与食品检验检疫技术中心实验室保存的分离自上海口岸进境产品的49株阪崎肠杆菌，开展耐药性测试。采用法国梅里埃Vitek 2.0全自动微生物分析系统，并严格按照操作说明进行抗生素敏感性试验，建立菌种培养测试条件，以及该种致病菌的耐药性分析图谱，并与基因测序结果进行比对分析，完成49株细菌的耐药性测试，汇总分析测试结果。结果显示，49株C. sakazakii对氨曲南、亚胺培南等13种抗生素敏感，1株C. sakazakii为多重耐药菌，对头孢替坦、头孢唑啉呈抗性。

关键词 阪崎克罗诺杆菌；耐药性；全基因组

 Drug Resistance Test of  Cronobacter   sakazakii  Isolated from Imported Infant Formula

FAN Yan-Li1  QIU Wei-Ke1  YUAN Chen-Gang1  SHI Yi-Yin1  YANG Hui-Qin1  YANG Jie-Lin1

Abstract Cronobacter sakazakii (formerly named Enterobacter sakazakii) is the representative species of Cronobacter spp. which is often contaminated in infant formula. The drug resistance of 49 strains of Cronobacter sakazakii isolated from imported products at Shanghai port was tested to establish the drug resistance analysis map of the pathogenic bacteria. The French Merieux vitek 2.0 automatic microbial analysis system was used to conduct antibiotic sensitivity test in strict accordance with the operating instructions. The strain culture, test conditions and the resistance analysis map of the pathogenic bacteria were established and compared with gene sequencing results. The resistance test of 49 strains of bacteria was completed, and the test results were summarized and analyzed and compared with gene sequencing results.The results showed that 49 strain of C. sakazakii was sensitive to 13 kinds of antibiotics such as aztreonam, imipenem and so on. One strain of C. sakazakii was multi-resistant to cefotetan and cefazolin.

Keywords Cronobacter sakazakii; drug resistance; whole genome sequence

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii, C. sakazakii）是克罗诺杆菌属（原为阪崎肠杆菌）代表菌种，是该属的主要致病菌，易使免疫力低下的各年龄段人群患病^[1-2]，可引起新生儿患严重的败血症、脑膜炎、坏死性结肠炎等^[3] 。2002年，国际微生物食品标准委员会将阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii, E. sakazakii）划分为对部分人群存在严重危害的致病菌^[4]。2004年联合国粮农组织/世界卫生组织（FAO/WHO）将阪崎肠杆菌划分为A类致病菌。

2007年Iversen等^[5]运用多相分析方法对210株阪崎肠杆菌进行了鉴定分析，重新建立克罗诺杆菌Cronobacter gen. nov.新属。2012年Joseph等^[6]按照16s基因分型等将克罗诺杆菌Cronobacter spp.分成7个种。此后克罗诺杆菌Cronobacter spp.的组成基本确立，未再发生变化。

本项目对上海口岸进境产品中分离获得的49株阪崎克罗诺杆菌菌株开展耐药性测试，建立该种致病菌的耐药性分析图谱。采用法国梅里埃Vitek 2.0全自动微生物分析系统，严格按照操作说明进行抗生素敏感性试验，完成49株细菌的耐药性测试，并将测试结果汇总分析。同时，采用测序的方法对菌株基因组中带有的耐药基因进行检测，并与耐药表型进行比对，为该菌防控提供了理论依据，也为食品安全提供了技术保障。

1  实验材料、试剂、仪器 

1.1 菌株信息

测试菌株：49株阪崎肠杆菌，由上海海关动植物与食品检验检疫技术中心实验室于自2005年起在上海口岸进口乳制品中分离获得，-80℃条件下甘油保存。各菌株的基本信息见表1。

表1  菌株基本信息

Table 1  Informations of all E. sakazakii isolates

1.2 实验试剂

L B 营养肉汤；DNA 抽提试剂盒（QIAGEN）；PCR 试剂盒（KOD）；引物由 Invitrogen 公司合成；阪崎肠杆菌显色培养基（Oxoid）及主要生化试剂为美国 Sigma 公司产品或国产AR级产品；Ex Taq DNA聚合酶、Easy Taq DNA 聚合酶、dNTP、标准分子量核酸DNA Marker2000、DNA Marker500 [宝生物工程（大连）有限公司]；DNA凝胶回收试剂盒（美国Axygen公司）；无核酸酶水Nuclease-Free Water （美国Ambion公司）；Gold View 核酸染料[宝生物工程（大连）有限公司]；QIAEX II Gel Extraction Kit（20021）（Qiagen, Germany）。

1.3 实验仪器

AgaroPower^™电泳仪[柏奥易杰（北京）科技有限公司]；数显恒温水浴锅HH-1（金坛市富华仪器有限公司）；台式低温高速离心机（德国Eppendorf公司）；恒温金属水浴锅（北京长安科学仪器厂）；超净工作台（北京东联哈尔滨仪器制造有限公司）；台式高速离心机（北京泰泽瑞达科技有限公司）；Nanodrop 2.0（美国Thermo公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；Qubit^® 2.0 荧光计（美国Invitrogen公司）；紫外凝胶成像仪（德国KODAK公司）；Agilent 2100（美国Agilent公司）；HPS-250生化培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；PCR仪（Lab Cycler D-37085）（德国Senso Quest Gmb H公司）；VETIK全自动微生物分析系统（法国Mérieux公司）；二代测序仪器 Ilumina PE150（美国Illumina公司）。

2  实验方法

2.1 阪崎克罗诺杆菌的保存与复苏

2005—2006年，参照美国食品药品监督管理局（FDA）和加拿大卫生部健康产品和食品部的推荐方法^[7-9]，对进口乳制品进行预处理和阪崎肠杆菌的分离。生化鉴定按API 20E试剂条的产品说明书进行操作，共计分离得到49株菌，并留样于-80℃的条件下。现取冻干保存的49株菌，划线接种于TSA平板上，37℃恒温培养24 h，再挑取单菌落接种于5 mL TSB培养基中，37℃恒温摇床培养10 h左右，至细菌变浑浊，最后制成菌液。

2.2 阪崎克罗诺杆菌耐药性测试

使用法国梅里埃Vitek 2.0全自动微生物分析系统，并严格按照操作说明进行抗生素敏感性试验，包括头孢唑啉、头孢替坦、阿米卡星、氨曲南、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、环丙沙星、厄他培南、庆大霉素、亚胺培南、呋喃妥因、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素、复方新诺明、左旋氧氟沙星共16种抗生素被选择用于耐药性分析。根据PhoenixTM100指南，耐药性试验结果分别由抗性（Resistance, R）；中性（Intermediate,Ⅰ）；敏感（Sensitive, S）和最低耐药浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）表示。大肠埃希菌ATCC 25922和大肠埃希菌ATCC 35218被用作质量控制生物体，并且根据制造商的建议包含在每次运行中。

2.3 阪崎肠杆菌DNA的文库构建和测序

对DNA碎片进行环化扩增，产物随机打断为350 bp左右的片段，并用探针捕获环化引物两侧的序列，用于后续DNA文库的构建。处理完成后的DNA片段，经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备。文库构建完成后， 先使用 Qubit 2.0 进行初步定量，稀释文库至 2 ng/μL，随后使用 Agilent 2100 对文库的插入片段（insert size）进行检测，insert size符合预期后，使用 Q-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求富集后进样，在 Illumina Hiseq 2000 上完成测序。

3  结果分析

49株C. sakazakii菌株的耐药性试验结果见表2和表3。由表2可知，所有C. sakazakii菌株对氨曲南、亚胺培南、厄他培南、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明、哌拉西林/他唑巴坦共13种抗生素敏感，且不同序列型的C. sakazakii菌株对这13种抗生素的最低耐药浓度（MIC值）也完全一致（见表2）。比较C. sakazakii对不同抗生素的MIC值可知，C. sakazakii对环丙沙星、左旋氧氟沙星抗生素（≤0.25 μg/mL）的敏感度最高，说明环丙沙星、左旋氧氟沙星抗生素的杀菌效果最明显，将对临床治疗因感染C. sakazakii患者的用药具有一定指导意义。表3列出了所有菌株对头孢替坦、头孢唑啉、呋喃妥因的耐药性试验结果，所有菌株对呋喃妥因敏感，而不同的菌株对呋喃妥因的敏感度不同，但整体范围在16～32 μg/mL之间，未表现出序列特异性。值得注意的是，所有C. sakazakii菌株对头孢替坦（三代头孢）的最低耐药浓度均为4 μg/mL，但不同序列型的C. sakazakii菌株对头孢唑啉（一代头孢）的最低耐药浓度不同，说明C. sakazakii是多重耐药菌。Lee的研究也曾指出C. sakazakii的多重耐药性^[10]。

表2  阪崎克罗诺杆菌对13种抗生素的耐药性结果

Table 2  Statistical of the resistance of C. sakazakii to 13 antibiotics

不同序列型C. sakazakii菌株对头孢唑林的耐药性有明显差异，按照C. sakazakii 菌株针对头孢唑啉的MIC值不同分为3组（MIC-1≤4 μg/mL，4＜MIC-2≤8 μg/mL，8＜MIC-3≤16 μg/mL），结果显示，32株 ST13 C. sakazakii菌株中29株的MIC值都是≤4 μg/L，只有CS-30、CS-61、CS-62的MIC值＝16 μg/L，说明相同序列型的菌株对头孢唑啉的MIC值倾向于一致。Peng Fei等研究显示大部分ST4 C. sakazakii菌株对头孢唑啉MIC值是＞4和≤8 μg/L ^[11]。但本研究结果中所有ST4 C. sakazakii菌株对头孢唑啉MIC值均≤4 μg/L，说明菌株个体差异可能导致不同个体的ST4 C. sakazakii菌株表现出不同的耐药性（见表4）。

菌株测序后，测序序列提交ARDB数据库注释。ARDB（Antibiotic Resistance Genes Database)数据库是用于检索耐药基因的数据库，通过基因比对可找到和耐药性相关的基因，以及所耐受的抗生素种类等信息。由注释结果可知C. sakazakii存在抗头孢菌素、沙星类药物、氨基糖苷类、甘氨酰、大环内酯类、吖啶黄类抗生素的耐药基因（mdtH、bla_c、bacA、tolC、ksgA、acrA、macB、emrD等），其中C. sakazakii存在对耐头孢菌素的基因（bla_c）。该结果与耐药性试验结果中C.sakazakii对头孢唑啉和头孢替坦的抗性结果一致，即在分子水平上解释了C. sakazakii对头孢唑啉和头孢替坦的抗性。但由C. sakazakii的ARDB数据库的注释结果可知，C. sakazakii存在耐依诺沙星和诺氟沙星的耐药基因（mdtK），与耐药性试验结果C. sakazakii对环丙沙星、左旋氧氟沙星敏感的结果相反，推测可能因为随着制药技术的不断发展，抗生素更新换代迅速，质量较过去有大幅提升，杀菌效果增强，使得存在耐沙星类药物基因的C. sakazakii菌株现在却对环丙沙星和左旋氧氟沙星敏感。

4  结论

上海海关多次对进口婴幼儿配方奶粉进行阪崎肠杆菌污染的专项抽查，检出比例约9.14%，高于文献中的报道^[12-14]。《婴幼儿配方乳粉生产许可审查细则（2013版）》明确指出，婴幼儿配方奶粉中不得检出阪崎肠杆菌^[15]。

表3  阪崎克罗诺杆菌对头孢替坦、头孢唑啉、呋喃妥因的耐药性结果

Table 3  Statistical of the resistance of C. sakazakii to cefotetan, cefazolin, nitrofurantoin

表4  不同序列型阪崎克罗诺杆菌对头孢唑林的耐药性差异结果

Table 4  Statistics of the differences of resistance to cefazolin in C. sakazakii strains

耐药性试验结果显示C. sakazakii为多重耐药菌，对头孢替坦、头孢唑啉呈抗性，且C. sakazakii对头孢唑啉的耐药程度表现出一定的序列相关性。同时，49株C. sakazakii对氨曲南、亚胺培南、厄他培南、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、复方新诺明、哌拉西林/他唑巴坦共13种抗生素敏感，其中对环丙沙星、左旋氧氟沙星的敏感度最高（MIC为0.25 μg/L）。与刘秀梅等研究结果一致，所有阪崎肠杆菌均对万古霉素、苯唑西林和青霉素G耐药，除l株阪崎肠杆菌外，其他菌株同时对头孢唑林和头孢泊肟耐药；所有茵株对13种以上的抗生素敏感^[16-17]。

C. sakazakii耐药性试验结果显示所有C. sakazakii对头孢唑啉和头孢替坦表现为耐药，与黄玉兰等研究发现克罗诺杆菌对二代头孢类药物耐受性较高结论一致^[18]。C. sakazakii中预测存在的耐头孢菌素基因（bla_c），说明基于组学的耐药性分析可能为C. sakazakii耐药性研究提供一种有价值的手段。C. sakazakii对环丙沙星和左旋氧氟沙星抗生素最敏感，对头孢唑啉和头孢替坦表现为耐药，对感染C. sakazakii患者的临床治疗具有一定指导意义。

随着基因组测序技术的发展和三代测序的出现，使得二代测序技术的性价比大幅提高，将二代测序技术应用于物种鉴定将是未来的发展趋势。此外，测序获得的基因组信息，不仅可用于物种鉴定和分型研究，还附带额外的附加值，可对基因功能进行注释，挖掘不同类型病原菌致病性及耐药性等特性^[19]，为进一步的实验室工作提供一定的理论依据。进一步结合耐药试验，更能对未来临床治疗治愈病原菌感染疾病提供指导。

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 （文章类别：CPST-C）