庄 鹏1 吴天良1 戴小丽1

摘 要 建立了高效液相色谱-串联质谱法测定海南热带水果中18种杀菌剂含量的方法，并对方法的提取溶剂、净化方式和质谱条件进行了研究。方法采用乙腈作为提取溶剂，PSA分散固相萃取净化，液相色谱-质谱/质谱进行检测，外标法定量。结果表明，方法检出限为0.58～1.7 μg/kg，以热带水果番荔枝和红毛丹为样品基质添加回收，回收率范围为74.5%～105.5%，相对标准偏差在2.3%～14.1%之间。经方法学验证和样品实测，本方法前处理简便、准确、重现性好、检出限低，适用于海南热带水果中18种常用杀菌剂的含量测定。

关键词 QuEChERS；高效液相色谱-串联质谱；热带水果；杀菌剂

 Determination of 18 Fungicide Residues in Tropical Fruits in Hainan

ZHUANG Peng1  WU Tian-Liang1  DAI Xiao-Li1

Abstract A method for the determination of 18 fungicides in tropical fruits of Hainan Province by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry was established. The extraction solvent, purification method and mass spectrometry conditions were also studied. Acetonitrile was used as extraction solvent. The samples were purified by PSA dispersion solid phase extraction, detected by liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry and quantified by external standard method. The detection limit was 0.58-1.7 μg/kg, using Annona squamosa and rambutan tropical fruits as negative samples, the Annona squamosa Linn and Nephelium lappaceum L. The recoveries ranged from 74.5% to 105.5%, the relative standard deviations were 2.3%-14.1%. The method is simple, accurate, reproducible and has low detection limit. It is suitable for the determination of 18 commonly used fungicides in tropical fruits in Hainan. 

Keywords QuEChERS; LC-MS/MS; tropical fruit; bactericide

热带水果产业是海南省的支柱产业之一，自海南国际旅游岛建设以来，海南热带水果产业有了长足发展^[1]。海南地处热带，温湿度高，热带水果在种植、采摘、贮藏和运输等过程中容易被细菌和真菌感染，发生植株病害和果实腐烂现象，所以杀菌剂被广泛运用于热带水果生产的各个环节。但杀菌剂的不合理使用，也成为影响海南热带水果品质的不安全因素之一^[2-3]。

杀菌剂传统的检测方法主要集中在气相色谱法、气相色谱-质谱法以及高效液相色谱法等^[4-13]，与之应用在前处理的方法有固相微萃取法（SPME）、固相萃取法（SPE）和凝胶色谱法^[14-15]等。由于蔬菜水果基质本体复杂，不仅提取和净化过程烦琐、时间长、效率低，而且前处理和净化过程中带来的干扰很大，浓缩后目标物的回收率不稳定，配套的前处理设备价格昂贵、操作可行性低。随着新农药化合物的出现，农药结构也越来越复杂，理化性质和极性相差较大，例如：对色素含量较大的植物源性食品，GCB的使用会对平面环形结构的农药噻菌灵回收率产生影响^[14]。对于多种杀菌剂来说，提取时间越长越复杂，涉及的实验过程越多，对杀菌剂的提取回收率就越差，尤其是对于降解速率相对较快的杀菌剂，检测结果的不准确性也会相对加大^[15]。本方法参照QuEChERS的应用基础，对18种杀菌剂检测运用简单的液液萃取方法，利用杂质与吸附物质的相互作用达到净化的目的，净化方式简单、效果好，回收率损失低。同时，本研究针对海南多种热带水果种植生长过程中可能使用的多种杀菌剂，建立了18种杀菌剂的多残留快速检测技术，并对提取溶剂、净化方法、仪器条件等进行深入研究。结果表明，该方法可对蔬菜和水果中的18种杀菌剂进行快速筛查和准确定量。

1  实验部分

1.1 试剂与仪器

乙腈（色谱纯，美国 TEDIA公司）；甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）；甲酸（色谱纯，美国TEDIA公司）；PSA（美国Agilent公司）；微孔滤膜（有机系，0.22 μm孔径）；标准品：质量浓度均为100.0 μg/mL的18种杀菌剂（农业农村部环境保护科研监测所，质量分数≥99.0%），分别为甲霜灵标准品、戊唑醇标准品、腈苯唑标准品、烯酰吗啉标准品、腈菌唑标准品、三唑醇标准品、烯唑醇标准品、噻菌灵标准品、嘧菌酯标准品、啶酰菌胺标准品、三环唑标准品、氯苯嘧啶醇标准品、霜霉威标准品、三唑酮标准品、乙霉威标准品、肟菌酯标准品、抑霉胺标准品、嘧霉胺标准品；标准储备液：用甲醇溶液配制成1.0 μg/mL的液体，-20℃避光保存。

高效液相色谱仪串联质谱仪（美国Agilent公司 1200系列，美国SCIEX公司 API4000Q四极杆质谱仪），电喷雾离子源；Harvard II注射针泵（美国SCIEX公司）；磁力搅拌器（德国艾卡公司）；Hettich 离心机（德国黑森林公司）；MS204TS 电子天平（梅特勒-托利多公司）；氮吹浓缩仪（美国Horizon-XcelVap ）。

实验选取了海南省典型的热带水果番荔枝（Annona squamosa Linn.）和红毛丹（Nephelium lappaceum L.） 作为样品，分别采集于海口、三亚、陵水、文昌、保亭，具体情况见表1。

表1  采集数量和采集地点

Table 1  Collection quantity and location

1.2 样品预处理

将番荔枝样品称重，去果核后用匀浆机组织粉碎；将红毛丹样品去皮后称重，去果核后用匀浆机组织粉碎。于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中准确称取均质的样品10 g（精确至0.001 g），加入20 mL乙腈、4 g无水硫酸镁、1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠、0.5 g柠檬酸二钠，涡旋3 min，9000/min离心5 min；取上清液1 mL，加入1 mL水，加入1 g PSA粉末净化，涡旋混合2 min，离心3 min后过0.22 μm有机滤膜，待测。

1.3 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK C₁₈ MG 2.0 mm I. D.×150 mm，5 μm；柱温：30℃；流速：0.6 mL/min；进样量：10 μL；流动相、洗脱条件见表2。

表2  流动相梯度洗脱条件

Table 2  Gradient elution conditions of mobile phase

1.4 质谱条件

(1) 电喷雾离子源（ESI⁺），正离子扫描；

(2) 离子源温度550℃，离子源电压5500 V；

(3) 雾化器温度500℃；

(4) 多反应监测（MRM）模式；

(5) 雾化气流速1000 L/h；

(6) 锥孔气流速50 L/h，以高纯氮气作为通用气体应用在雾化气、气帘气、辅助气和碰撞气中。MRM离子扫描参数见表3。

2  结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

杀菌剂的提取溶剂通常是乙酸乙酯、丙酮和乙腈。乙酸乙酯一般对于高脂肪含量的非极性物质具有很好的提取效果，但是对于在水中溶解度相对较大的杀菌剂，如戊唑醇、霜霉威、甲霜灵的提取效率低。丙酮对植物的色素分离具有非常好的效果，但是极易溶于水，在液液萃取过程中因蔬菜和水果富含大量水分，导致提取过程中无法分离丙酮和水分。乙酸乙酯和丙酮作为提取溶剂，在定容上机过程中需要转换溶剂，会导致回收率的损失，因此在本方法中首选乙腈作为溶剂。在QuEChERS方法^[16]中，乙腈作为常用的提取溶剂被广泛应用在农药残留检测中。由于水果含糖量较高，乙腈对糖类的提取能力较弱^[17-19]，但对杀菌剂的提取效率很好，能够最大限度地提取热带水果中的杀菌剂残留，并使提取液中的干扰物较少^[20-22]，所以本实验采用乙腈作为提取溶剂^[23-26]。

表3  MRM模式下18种杀菌剂的扫描参数 

Table 3  Scanning parameters of 18 fungicides under MRM mode 

2.2 净化条件的选择

对比了十八烷基硅胶键合相（C₁₈）、石墨碳黑（GBC）和N-丙基乙二胺键合相（PSA）的净化效果。采用C₁₈的净化方式，目标物被吸附，回收率低且除杂不完全，谱图显示干扰较大，对比未处理的样品谱图，则显示出非目标物峰；采用GBC净化方式后，目标物被大量吸附，谱图显示目标物无法正常出峰；采用PSA对提取液进行净化，目标物的整体回收率最高，且整体较为稳定，满足检测要求。因此，最终选择PSA作为净化剂。不同净化方式的MRM色谱图见图1～图4。

图1  水果样品未净化MRM色谱图

Fig.1  MRM chromatogram of unpurified fruit samples

图2  水果样品经过C18净化后MRM色谱图

Fig.2  MRM chromatogram of fruit samples purified by C18

图3  水果样品经过GBC净化后MRM色谱图

Fig.3  MRM chromatogram of fruit samples purified by GBC

图4  水果样品经过PSA净化后MRM色谱图

Fig.4  MRM chromatogram of fruit samples purified by PSA

 2.3 色谱条件优化

分别考察了去离子水、1‰甲酸水溶液、5.0 mmol/L乙酸铵水溶液对峰形、响应值等的影响。结果表明，以去离子水作为流动相时回收率和灵敏度均不高；1‰甲酸水溶液让噻菌灵和霜霉威的峰形变宽变矮，并出现明显的分叉现象，且采用1‰甲酸水溶液作为流动相会让基线变高，降低仪器响应信噪比，无法准确定性出峰时间。因此，选择5.0 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相，见图5和图6。

图5  甲酸-水溶液体系和乙酸铵-水溶液体系中霜霉威的MRM色谱图

Fig.5  MRM chromatorgrams of propamocarb pesticides in formic acid-aqueous solution system and ammonium acetate-aqueous solution system

图6  甲酸-水溶液体系和乙酸铵-水溶液体系中霜霉威的MRM色谱图

Fig.6  MRM chromatorgramsof propamocarb pesticides in formic acid-aqueous solution system and ammonium acetate-aqueous solution system

 2.4 线性关系及检出限

标准溶液配制采用热带水果提取的基质液（按照提取液∶水＝1∶2配制）定容。因为直接用纯的有机试剂配制会造成基质减弱效应，使得峰形分叉、峰形变宽，无法准确定性，回收率低，不利于准确定量。而采用基质提取液配置标准溶液，可以有效减少基质效应，提高灵敏度，使峰形正常，减少对回收率的影响。

将18种杀菌剂混合标准储备液（浓度为1.0 μg/mL）用乙腈定容，配制成18种杀菌剂混合标准工作液（浓度为0.1 μg/mL），准确吸取工作液12.5 μL、25.0 μL、50.0 μL、100.0 μL、200.0 μL、400.0 μL，分别用基质提取液准确定容至1.0 mL，得到浓度为1.25 ng/mL、2.50 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、40.0 ng/mL的18种杀菌剂混合标准工作液曲线。依次进样，得到MS响应值（峰面积Y）与质量浓度（X）的线性回归方程，外标法定量。以3倍信噪比（S/N）计算检出限（Limit of Detection, LOD）。结果计算值＝仪器值×称取样品的质量/样品均质前总质量，结果表明，在1.25～40.0 ng/mL的质量浓度范围内，水果基质提取液中的18种目标杀菌剂呈良好的线性关系，相关系数r均＞0.99，数据见表4，方法检出限范围在0.58～1.7 μg/kg，符合GB/T 27404-2008 《实验室质量控制规范 食品理化检测》中校准曲线的线性方程相关系数不低于0.99的要求。

2.5 回收率与精密度试验

本方法以海南省市面上较常见的热带水果番荔枝和红毛丹作为样品基质进行加标回收率和精密度试验，称取10 g（精确至0.001 g）样品进行3水平加标（0.005 mg/kg、0.010 mg/kg、0.020 mg/kg）、7个平行的加标回收率试验，测定后得到18种杀菌剂的回收率和相对标准偏差，样品基质的平均回收率范围为74.5%～105.5%，相对标准偏差在2.3%～14.1%之间，具体结果见表5和表6。

表4  18种杀菌剂的线性方程及相关系数

Table 4  The linear equations and correlation coefficients of the 18 fungicides

表5  番荔枝中18种杀菌剂的平均回收率和相对标准偏差（n＝7）

Table 5  The average recoveries and RSDs of 18 fungicide pesticides in sweetsop  (n＝7)

表6  红毛丹中18种杀菌剂的平均回收率和相对标准偏差（n＝7）

Table 6  The average recoveries and RSDs of 18 industrial bactericide pesticides in rambutan (n＝7)

表7  海南热带水果中检测出的杀菌剂种类、检出率、检出总量的情况

Table 7  Species, detection rate and total amounts of fungicides detected in tropical fruits in Hainan

2.6 实际样品检测

基于以上建立的检测方法，在海南省范围内采集了番荔枝和红毛丹共58份样品，分别测定18种杀菌剂（腈菌唑、甲霜灵、戊唑醇、三环唑、烯唑醇、腈菌唑、霜霉威、三唑醇、氯苯嘧啶醇、嘧菌酯、噻菌灵、啶酰菌胺、肟菌酯、三唑酮、乙霉威、抑霉唑、嘧霉胺、烯酰吗啉）含量，并对18种杀菌剂污染状况整体进行分析，具体检出情况见表7。

3  结论 

本研究将QuEChERS技术与液相色谱串联质谱相结合，采用乙腈作为提取溶剂，PSA作为净化剂，以热带水果为基质，对其杀菌剂残留检测方法为研究对象，建立了热带水果中18种杀菌剂（腈菌唑、甲霜灵、戊唑醇、三环唑、烯唑醇、腈菌唑、霜霉威、三唑醇、氯苯嘧啶醇、嘧菌酯、噻菌灵、啶酰菌胺、肟菌酯、三唑酮、乙霉威、抑霉唑、嘧霉胺、烯酰吗啉）残留含量的分析方法。通过对番荔枝（Annona squamosa Linn.）和红毛丹（Nephelium lappaceum L.）基质经方法学验证和大量样品实测，发现各组分在1.25～40.0 ng/mL范围内线性良好，回收率范围为74.5%～105.5%，相对标准偏差在2.3%～14.1%之间，18种杀菌剂的方法检出限为0.58～1.7 μg/kg，均低于GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》的最低限量要求10.0 μg/kg。该方法快速高效、操作简便、定量准确，适用于各种热带水果中杀菌剂残留含量检测。

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