人参和西洋参的HPLC指纹图谱及化学模式识别研究-中国口岸科学技术-2021年05期

人参和西洋参的HPLC指纹图谱及化学模式识别研究

作者：宋茜1 孔祥词1 陈树东1 陈文锐2 胡文军1* 李荀2

摘要通过采集人参和西洋参的HPLC图谱，结合化学模式识别方法全面比较二者主成分的差异，为人参和西洋参的鉴别提供科学依据。采用经过优化的提取条件和色谱条件建立人参、西洋参的HPLC指纹图谱；采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”进行相似度评价；采用SPSS 21.0软件进行聚类分析和主成分分析。所建HPLC指纹图谱共筛选出20个共有峰，指认出其中3个成分；通过相似度分析，可以将人参和西洋参区分开，国产西洋参和进口西洋参也存在显著性差异；聚类分析和主成分分析均将样品分为2类。本研究建立的方法简便、快速，可以用于人参和西洋参的鉴别研究，也为参类产品质量评价提供了科学依据。

宋茜1 孔祥词1 陈树东1 陈文锐2 胡文军1* 李荀2

关键词人参；西洋参；指纹图谱；聚类分析；主成分分析

Study on HPLC Fingerprint and Chemical Pattern Recognition of Ginseng Radix et rhizoma and Panacis quinquefolii radix

SONG Qian1 KONG Xiang-Ci1 CHEN Shu-Dong1 CHEN Wen-Rui2 HU Wen-Jun1* LI Xun2

Abstract To establish the fingerprint of Ginseng Radix et rhizoma and Panacis quinquefolii radix respectively, and to compare the difference of principal components by chemical pattern recognition method, and to provide scientific basis for the identification of Ginseng Radix et rhizoma and Panacis quinquefolii radix. The optimized sample preparation and HPLC conditions was adopted to establish the fingerprint of Ginseng Radix et rhizoma and Panacis quinquefolii radix. The similarity of 26 batches of samples was evaluated by TCM Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System (2012). Cluster analysis and principal component analysis were performed by using SPSS 21.0 software. There were 20 common peaks in HPLC fingerprints of 26 batches of samples, and 3 components were identified. Radix et rhizoma could be distinguished from Panacis quinquefolii radix by similarity analysis, and obvious differences were also revealed between domestic and imported Panacis quinquefolii radix. The samples were divided into two categories by cluster analysis and principal component analysis. The method established in this study is simple and fast. It can be used to identify Radix et rhizoma and Panacis quinquefolii radix and provide scientific basis for quality evaluation of ginseng products.

Keywords Radix et rhizoma; Panacis quinquefolii radix; fingerprint; cluster analysis; principal component analysis

人参主要分布在亚洲大陆东部中高纬度地区，大致是北纬35°至北纬42°之间，即中国东北三省、朝鲜半岛、日本和俄罗斯等国家和地区，人工栽培种植人参的国家主要有中国、韩国、朝鲜和日本。中国人参主要产区范围南起辽宁省宽甸满族自治县，北至黑龙江省勃利县一带，中心产区为吉林省抚松县和长白县^[2]。西洋参产地主要位于北美洲加拿大的蒙特利尔、魁北克、温哥华山区和美国东部，20世纪70年代我国开始引进西洋参，其主要成分与进口西洋参成分基本相同^[4]。由于人参与西洋参是同属不同种的草本植物，外观性状较为相似，主要药效成分一致，市场上参类产品鱼龙混杂、良莠不齐，严重影响广大消费者的选择与食用。目前单一研究人参或西洋参药材的指纹图谱文献较多^[5-8]，严华等进行了人参与西洋参的特征图谱研究，指出了特征成分和共性成分^[9]，但尚未见学者进行人参与西洋参的指纹图谱全面比较研究。本研究收集了不同产地、不同制法的人参和西洋参，建立了人参和西洋参的HPLC指纹图谱，并结合聚类分析和主成分分析对人参和西洋参进行化学模式识别研究，全面比较二者化学成分的差异，为人参和西洋参的鉴别提供科学依据。

1 仪器和材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪（赛默飞世尔，UltiMate 3000）；电子天平（德国赛多利斯公司）；超声波发生器（SB-500DTY，宁波新芝生物科技股份有限公司）；电热恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）。

1.2 材料

人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（分析纯，广州化学试剂厂），乙腈（色谱纯，德国Merck公司），超纯水（Millipore纯水机）。16批人参药材经权威专家鉴定为五加科植物人参Panax gingseng C.A.Mey.的根，10批西洋参药材经鉴定为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的根，样品来源信息见表1。

表1 人参与西洋参药材样品信息

Table 1 Information of Ginseng Radix et rhizoma and Panacis quinquefolii radix

样品编号	品名	产地
R1	人参	中国吉林
R2	人参	中国吉林
R3	人参	中国辽宁
R4	人参	中国辽宁
R5	人参	中国黑龙江
R6	人参	中国黑龙江
R7	生晒参	中国吉林长白山
R8	生晒参	中国吉林长白山
R9	池底参	中国吉林长白山
R10	池底参	中国吉林长白山
R11	池底参	中国吉林长白山
R12	高丽红参	中国吉林长白山
R13	高丽红参	中国吉林长白山
R14	高丽参	韩国
R15	高丽参	韩国
R16	高丽参	韩国
X1	西洋参	中国山东
X2	西洋参	中国山东
X3	西洋参	中国山东
X4	西洋参	中国北京
X5	西洋参	中国北京
X6	西洋参	美国
X7	西洋参	美国
X8	西洋参	加拿大
X9	西洋参	加拿大
X10	西洋参	加拿大

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Thermo Syncronis C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），洗脱梯度（0～9 min，10%～13% A；9～14 min，13%～30% A；14～35 min，30%～41% A；35～40 min，41%～78% A；40～48 min，78%～90% A；48～56 min，90%A）；柱温30℃；流速1.0 mL/min；检测波长203 nm；进样量：20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

按照药典方法配制对照品混合溶液，最终浓度分别为人参皂苷Re 0.4 mg、人参皂苷Rb 11.0 mg、人参皂苷Rg 10.1 mg。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取样品粉末约2 g，置具塞锥形瓶中，用50 mL甲醇（70%溶液）浸泡3 h，超声处理两次，每次30 min，合并滤液，置蒸发皿中蒸干，残渣加70%甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤后备用。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

精密称取编号为R9的人参药材样品，按上述方法进行连续6次测定，以9号峰（人参皂苷Rb1峰）为参照峰（S），计算得到各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均＜2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

分别精密称取编号为R9的人参药材样品6份，按上述方法进行重复性测定，以9号峰（人参皂苷Rb1峰）为参照峰（S），计算得到各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均＜2.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

精密称取编号为R9的人参药材样品，按上述方法制备试液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，以9号峰（人参皂苷Rb1峰）为参照峰（S），计算得到各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均＜2.0%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 HPLC指纹图谱研究

2.5.1 指纹图谱的建立

分别取16批人参药材和10批西洋参药材进行测定，采集HPLC谱图，结果见图1。经多点校正、取中位值得到相似度评价谱图（分别以R1和X1样品色谱图为参照图谱），结果见图2。

图1 人参（A）与西洋参（B）的HPLC叠加指纹图谱

Fig.1 HPLC superimposed fingerprints of Radix et rhizoma(A) and Panacis quinquefolii radix(B)

图2 人参（A）与西洋参（B）的HPLC对照指纹图谱

Fig.2 HPLC control fingerprints of Radix et rhizoma(A) and Panacis quinquefolii radix(B)

2.5.2 相似度评价

分别以人参对照图谱和西洋参对照图谱为参照图谱进行比较，将上述获得的HPLC图谱导入系统，自动计算出相似度，结果见表2、表3。

表2 以人参对照图谱为参照图谱的相似度评价结果

Table 2 Results of similarity evaluation based on control fingerprint of Radix et rhizoma

编号（人参）	相似度	编号（西洋参）	相似度	编号（人参）	相似度	编号（西洋参）	相似度
R1	0.932	X1	0.747	R9	0.920	X9	0.672
R2	0.934	X2	0.747	R10	0.919	X10	0.685
R3	0.911	X3	0.745	R11	0.901
R4	0.914	X4	0.746	R12	0.932
R5	0.932	X5	0.745	R13	0.938
R6	0.935	X6	0.791	R14	0.970
R7	0.972	X7	0.799	R15	0.971
R8	0.982	X8	0.681	R16	0.969

表3 以西洋参对照图谱为参照图谱的相似度评价结果

Table 3 Results of similarity evaluation based on control fingerprint of Panacis quinquefolii radix

编号（人参）	相似度	编号（西洋参）	相似度	编号（人参）	相似度	编号（西洋参）	相似度
R1	0.565	X1	0.990	R9	0.784	X9	0.975
R2	0.579	X2	0.994	R10	0.760	X10	0.976
R3	0.697	X3	0.991	R11	0.764
R4	0.696	X4	0.993	R12	0.646
R5	0.607	X5	0.989	R13	0.645
R6	0.610	X6	0.969	R14	0.708
R7	0.627	X7	0.970	R15	0.704
R8	0.687	X8	0.971	R16	0.712

表4 人参HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积

Table 4 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprints of Radix et rhizoma

峰号	R1	R2	R3	R4	R5	R6	R7	R8	R9	R10	R11	R12	R13	R14	R15	R16	（%）
1	0.627	0.588	0.075	0.078	1.156	1.143	0.844	0.592	0.130	0.131	0.135	0.086	0.114	0.269	0.275	0.261	92.1
2	1.375	1.282	0.315	0.319	1.229	1.210	1.604	1.174	0.282	0.294	0.303	1.336	1.371	0.871	0.904	0.885	51.2
3	0.468	0.442	0.169	0.158	1.137	1.111	0.547	0.389	0.508	0.575	0.573	0.085	0.080	0.183	0.193	0.144	77.5
4	0.052	0.051	0.034	0.033	0.080	0.081	0.060	0.043	0.038	0.035	0.037	0.002	0.001	0.065	0.067	0.065	51.1
5	0.222	0.136	0.194	0.085	0.130	0.121	0.155	0.116	0.121	0.102	0.115	0.086	0.090	0.108	0.111	0.107	30.0
6	1.339	1.263	1.044	1.115	0.804	0.788	0.902	0.629	0.476	0.473	0.496	0.392	0.402	0.311	0.318	0.321	50.7
7	1.842	1.714	0.253	0.258	1.081	1.077	1.072	0.775	0.869	0.856	0.835	0.891	0.914	0.807	0.817	0.789	44.1
8	0.544	0.489	0.179	0.181	0.243	0.247	0.350	0.254	0.187	0.179	0.186	0.236	0.243	0.250	0.253	0.250	40.2
9	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	0.0
10	1.667	1.584	1.298	1.334	0.586	0.600	0.797	0.614	0.310	0.579	0.593	0.421	0.436	0.426	0.427	0.412	59.5
11	0.866	0.807	0.821	0.829	0.483	0.480	0.537	0.386	0.312	0.313	0.314	0.418	0.426	0.384	0.386	0.372	39.8
12	0.132	0.125	0.154	0.158	0.052	0.054	0.064	0.047	0.047	0.047	0.048	0.033	0.034	0.026	0.026	0.026	69.6
13	0.124	0.114	0.169	0.173	0.092	0.089	0.156	0.108	0.057	0.058	0.057	0.083	0.083	0.085	0.086	0.085	36.9
14	0.351	0.415	0.569	0.593	0.190	0.189	0.293	0.202	0.116	0.117	0.116	0.154	0.143	0.064	0.065	0.063	75.2
15	0.064	0.059	0.045	0.046	0.070	0.069	0.088	0.072	0.037	0.044	0.041	0.387	0.176	0.368	0.363	0.363	97.1
16	0.799	0.767	0.285	0.301	0.630	0.651	0.952	0.700	0.199	0.204	0.213	0.266	0.241	0.531	0.544	0.517	50.6
17	1.128	1.056	1.225	1.257	1.489	1.447	2.172	0.592	0.455	0.449	0.449	1.088	1.126	1.306	1.317	1.263	40.8
18	0.091	0.101	0.167	0.170	0.124	0.127	0.152	1.174	0.019	0.019	0.018	0.085	0.084	0.032	0.034	0.032	183.1
19	0.168	0.150	0.055	0.060	0.177	0.164	0.199	0.389	0.027	0.028	0.028	0.058	0.062	0.024	0.023	0.025	97.8
20	0.960	0.886	1.032	0.078	1.185	1.130	0.954	0.043	0.188	0.189	0.178	0.731	0.737	0.392	0.376	0.368	68.3

2.5.3 共有峰的指认

16批人参样品和10批西洋参样品共有20个共有峰，经过与对照品比对，指认出其中3个成分，6号峰为人参皂苷Rg1，7号峰为人参皂苷Re，9号峰为人参皂苷Rb1。综合峰响应值和与其余峰的分离度，选择9号峰人参皂苷Rb1为内参照峰（S）。计算得到各共有峰的相对保留时间RSD均<1.50%，但相对峰面积的RSD较大，结果见表4、表5。

2.6 化学模式识别研究

2.6.1 聚类分析

将16批人参样品和10批西洋参样品的数据导入SPSS 21.0统计软件进行聚类分析，结果见图3。当类间距为12时，26批样品聚为两大类：R1～R16聚为一类，X1～X10聚为一类。

2.6.2 主成分分析

将16批人参样品和10批西洋参样品共有峰数据导入SPSS 21.0统计软件，进行主成分分析，得到相关矩阵的特征值及方差贡献率，结果见表6。以特征值>1为标准，得到4个主成分的累计方差贡献率为96.411%。主成分因子载荷矩阵结果见表7，主成分分析结果见图4，R1～R16聚为一类，X1～X10聚为一类，与聚类分析结果一致。

表5 西洋参HPLC指纹图谱共有峰的相对峰面积

Table 5 Relative retention time of common peaks in HPLC fingerprints of Panacis quinquefolii radix

峰号	X1	X2	X3	X4	X5	X6	X7	X8	X9	X10	RSD (%)
1	0.100	0.097	0.098	0.099	0.100	0.045	0.044	0.032	0.032	0.032	48.2
2	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.0
3	0.077	0.078	0.077	0.078	0.077	0.105	0.104	0.217	0.218	0.217	52.0
4	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.008	0.008	0.010	0.010	0.010	8.4
5	0.004	0.005	0.006	0.006	0.006	0.016	0.014	0.004	0.003	0.003	66.5
6	0.383	0.389	0.389	0.389	0.387	0.705	0.701	0.542	0.539	0.537	26.0
7	0.025	0.027	0.022	0.022	0.023	0.108	0.106	0.060	0.062	0.063	65.8
8	0.008	0.008	0.007	0.008	0.008	0.002	0.002	0.002	0.002	0.002	68.9
9	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	0.0
10	0.061	0.065	0.067	0.067	0.066	0.129	0.130	0.092	0.092	0.092	30.1
11	0.007	0.007	0.007	0.007	0.007	0.018	0.018	0.010	0.010	0.010	41.4
12	0.017	0.017	0.018	0.018	0.017	0.026	0.026	0.021	0.019	0.021	17.2
13	0.072	0.072	0.072	0.071	0.069	0.078	0.078	0.070	0.067	0.070	4.8
14	0.100	0.100	0.100	0.100	0.100	0.258	0.257	0.129	0.128	0.128	45.1
15	0.018	0.021	0.020	0.022	0.021	0.022	0.023	0.019	0.019	0.018	8.3
16	0.124	0.119	0.115	0.124	0.120	0.281	0.279	0.117	0.117	0.118	44.8
17	0.369	0.371	0.370	0.365	0.365	0.683	0.680	0.204	0.203	0.202	46.1
18	0.010	0.010	0.010	0.010	0.010	0.007	0.008	0.007	0.007	0.008	17.4
19	0.027	0.025	0.027	0.025	0.026	0.009	0.009	0.005	0.003	0.005	65.0
20	0.114	0.115	0.115	0.115	0.112	0.059	0.056	0.060	0.060	0.059	33.7

图3 人参和西洋参样品的聚类分析图

Fig.3 Dendrogram of cluster analysis of Radix et rhizoma and Panacis quinquefolii radix

表6 主成分因子的特征值和方差贡献率

Table 6 Eigen value and variance contribution rate of principal component factors

成分	特征值	方差贡献率 (%)	累积方差贡献率 (%)
1	16.658	64.069	64.069
2	4.875	18.751	82.820
3	1.829	9.111	91.931
4	1.165	4.480	96.411

图4 主成分分析三维得分图

Fig.4 3D score scatter plot by PCA

表7 主成分因子载荷矩阵

Table 7 Loading matrix of principal component factors

峰号	主成分1	主成分2	主成分3	主成分4
1	0.756	0.400	0.383	-0.232
2	0.839	0.404	-0.101	0.195
3	0.583	0.347	0.426	-0.527
4	0.747	0.403	0.023	-0.180
5	0.908	0.031	-0.153	-0.007
6	0.727	-0.572	0.169	-0.202
7	0.840	0.312	-0103	-0.092
8	0.916	0.149	-0.173	0.059
9	0.921	0.682	0.478	0.713
10	0.871	-0.404	-0.117	-0.015
11	0.922	-0.235	-0.221	0.044
12	0.734	-0.646	-0.089	-0.056
13	0.710	-0.535	-0.075	0.229
14	0.577	-0.788	-0.002	0.013
15	0.214	0.538	-0.668	0.401
16	0.888	0.262	0.102	0.107
17	0.809	0.177	-0.298	0.035
18	0.359	0.025	0.601	0.684
19	0.700	0.143	0.594	0.347
20	0.812	0.151	-0.149	-0.275

3 结果与讨论

3.1 提取条件的优化

按文献报道的提取条件进行试验和筛选，得到优化条件。结果表明，当用70%甲醇浸泡，再超声提取2次，每次30 min时，提取效率较高，可以获得较多的色谱峰信息，因此确定其为人参与西洋参的指纹图谱提取条件。

3.2 色谱条件的优化

按文献报道的各种色谱条件进行试验，获得最佳化的梯度洗脱程序。结果表明，在此条件下获得的峰数较多，峰形较好，谱图信息较为丰富，因此确定其为人参和西洋参的指纹图谱的色谱条件。

3.3 指纹图谱结果分析

采用获得的人参HPLC对照图谱，不同批次的人参样品相似度均＞0.900，相似度较高，而西洋参样品与人参对照图谱相比的相似度较低，在0.672～0.799之间；将人参与西洋参的相似度数据进行T检验，P<0.01，说明二者存在极显著性差异。由表3结果可知，采用获得的西洋参HPLC对照图谱，不同批次西洋参样品的相似度均＞0.960，相似度较高，而各人参样品与西洋参对照图谱相比的相似度较低，在0.565～0.784之间；将人参与西洋参的相似度数据进行T检验，P<0.01，同样表明二者存在极显著性差异。将国产西洋参与进口西洋参的相似度数据进行T检验，P<0.01，说明二者存在极显著性差异。通过相似度分析，可以将人参和西洋参区分开，国产西洋参和进口西洋参也存在显著性差异。