王 准1 李文君2 魏春艳1 李海滨1 刘丽玲1 高 明1 高 越1 刘金华1*

美澳型核果褐腐病菌[Monilinia fructicola (Winter) Honey]是我国法定禁止进境的检疫性真菌。美澳型核果褐腐病菌在北美洲、大洋洲、欧洲、亚洲的许多国家都有分布，在中国北京和台湾地区也有局部危害^[1]。该病原菌寄主范围广泛，可以侵染桃（Amygdalus persica）、油桃（Prunus persica）^[2]、李（Prunus）^[3] 等核果类植物，以及侵染苹果（Malus domestica）^[4]、梨（Pyrus communis）^[5]等仁果类水果，有报道称它还可以寄生在葡萄（Vitis vinifera）^[6]中。该病原菌主要为害花、果实、枝梢，对果实所产生的伤害最严重，从座果到果实成熟甚至储藏期都可能造成危害。侵害枝梢后，呈现中央凹陷状，如长圆形的溃疡斑，病斑呈灰褐色，边缘呈紫褐色；侵害叶部会造成叶片干枯凋萎；侵害花会造成花变褐色、干枯或腐烂。

美澳型核果褐腐病菌所造成的花枝枯萎、溃疡病、果实腐烂，将导致果实大面积减产，从而造成严重的经济损失^[7]。因美澳型核果褐腐病菌寄主广、危害严重，被列入欧洲和地中海植物保护组织（ European and Mediterranean Plant Protection Organization , EPPO）检疫性有害生物名单^[8]，并被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》^[9]。

美澳型核果褐腐病菌具有异常复杂的存活特点，从赤道以北的加拿大到赤道以南的阿根廷都发现过该病菌存活的痕迹，说明其分布面积较大，分布区域繁杂。赤道南北的地理环境、气候气象等有着极大差异，而该病菌在不同环境里都可以大面积繁殖存活，说明其在适应环境方面的能力较强。在多种因素合力的作用下，致使该病菌成活率极高，因为其具有极强的适应性，其寄生于宿主的选择性、可能性较大。综上所述，美澳型核果褐腐病菌具有极大的危害性。

我国地域辽阔，南北跨纬度广，地跨热带、北温带、北寒带，气温差异大，导致我国气候表现出层次分明、纷繁复杂的特点，这种地理环境、气候环境是适宜美澳型核果褐腐病菌滋生繁殖的天然温床。该病原菌依靠自身分布广、适应力强、成活率高、寄生能力强等特点，对我国主要类别的果木和果苗产生危害，可使大部分果木、果苗产量极低，甚至死亡，对我国水果种植业及农贸经济发展产生严重的负面影响。

本文通过对截获样品进行形态学与分子生物学方面的深入研究，掌握第一手资料，为美澳型核果褐腐病菌检疫与鉴定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器及用具

恒温培养箱（BINDER BD240）；光照培养箱（绿博 LFY）；生物显微镜（Zeiss Axio Imager A1）；PCR仪（eppendorf GSX1）；冷冻离心机（eppendorf FRESCO21）；凝胶成像系统（AlphaImager EC）。

1.2 病原菌分离

采用组织分离法^[10]，取测试样品病健交接处果肉，接种于PDA培养基的表面，23℃培养箱中进行12 h光照培养，经菌落纯化后备用。

1.3 致病性测定

采用菌丝块接种法，用直径为4 mm打孔器，取菌落边缘菌丝，待用。用70%乙醇对健康桃表面进行消毒，无菌条件下自然晾干，用灭菌刀在接种部位切取少量果肉，将菌丝块接种于果肉中，无菌PDA培养基做空白对照。将受试样品放入自封袋内，16℃恒温培养箱中保湿培养1周。

1.4 病原菌形态观察

将纯培养物接种于PDA培养基上，倒置平板，并在23℃培养箱中进行12 h光照培养，持续观察菌落形状及生长速率。观察时避免因剧烈晃动而导致孢子扩散，进而产生菌落蔓延现象。

1.5 分子生物学法鉴定

1.5.1 病原物DNA提取

无菌条件下，直接从病果表面灰白色绒状霉层处挑取待测菌种的菌丝体，并将菌丝体移入灭菌研钵中，用液氮将样品充分研成细粉，移入1.5 mL无菌离心管中，依照商品化试剂盒说明书操作，提取样品DNA。

1.5.2 核糖体ITS片段PCR扩增及克隆

采用真菌核糖体基因间隔区通用引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC -3'进行PCR扩增^[11]；30 µL PCR扩增反应体系：10×Buffer 3 µL；dNTP 4 µL；上下游引物ITS1/4各1 µL； Taq 0.3 µL；ddH₂O 18.7 µL；DNA模板2 µL。

PCR反应条件：95℃ 5 min；95℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s，25个循环；72℃ 10 min。

PCR反应结束后，取7 µL扩增产物于1.2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为100 V 30 min，电泳缓冲液为1×TAE。使用凝胶成像系统观察、拍照、记录检测结果。

将含有目的片段的凝胶回收纯化后，连接到克隆载体pMD18-T， 转化到DH5α感受态细胞中，经蓝白斑筛选，37℃摇床过夜。

1.5.3 测序与分析

将提取的质粒再次进行PCR反应并验证成功后，将菌液在-20℃中保存，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。收到测序结果后与NCBI数据库中已知序列进行BLAST比较，确定与试验菌株亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 症状特点

将人工接种桃样本置于恒温培养箱中保湿培养，3 d后观察样本表面。果实表面创伤处显现多个灰白色的菌落，且随着时间延长，菌落逐渐扩大成近圆形的绒状霉团，并高出于病果表皮上方。随着培养时间的继续延长，菌落不断蔓延，直至果实腐烂。

2.2 病果样品与人工接种病果对比

通过对比病果样品和人工接种桃样品的致病性测定可知，人工接种发病桃的症状与病果样品症状一致，如图1、图2所示。对照样品（见图3）未发病，并且从接种发病的桃上得到与原接种菌相同表征的病原菌。

图1 样品症状

Fig.1 Sample symptoms

图2 接种的桃发病症状

Fig.2 Symptoms of inoculated peach disease

图3 对照样品

Fig.3 Control sample

2.3 形态观察

2.3.1 病原形态学观察结果

在PDA培养基上，菌落形成初期为灰白色，随着菌落不断生长，菌落呈榛子色至灰褐色，边缘开裂，其菌落表面附着浓密分生孢子并堆积成同心环状，菌落颜色灰黄色，质地均匀，同心轮纹明显，菌落背面呈黑褐色，如图4、图5所示。23℃培养条件下，0～3 d生长量较小，3 d后菌落生长速度明显加快，10 d左右菌落长满9 cm平皿，病原菌直线生长速率约为9.2 mm/d。

图4 纯培养12 d后菌落正面图

Fig.4 Front view of pure cultivated colonies after 12 days

图5 纯培养12 d后菌落背面图

Fig.5 Back view of pure cultivated colonies after 12 days

2.3.2 菌丝体和孢子形态学观察

经显微镜观察，该病原菌的菌丝无色，菌丝直径平均约为7 µm；菌丝体顶端生长分生孢子，分生孢子成链状排列，单细胞，无色近透明，椭圆至柠檬状，如图6所示。

图6 美澳型核果褐腐病菌病原形态

Fig.6 Pathogen of Monilinia fructicola

2.4 分子生物学鉴定

2.4.1 核糖体基因ITS区段PCR扩增

利用真菌通用引物ITS1和ITS4对待测试菌株的DNA进行PCR扩增，1.2%琼脂糖凝胶电泳，在550 bp左右处出现特异条带，如图7所示。经PCR产物纯化克隆后，仍然能在550 bp左右出现特异条带，如图8所示。

注：1为DL2000Marker；2为样品；3为阳性对照；4为阴性对照

图7 对测试菌株DNA进行PCR扩增

Fig.7 DNA of the test strain amplified by PCR

注：1为DL2000Marker；2为样品；3为阴性对照

图8 PCR产物纯化克隆后

Fig.8 Purifiedand cloned PCR products

2.4.2 序列分析结果

在对PCR产物切胶回收后，将回收产物连接到克隆载体pMD18-T，并转化到DH5α感受态细胞中，提取质粒送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序后，得到长度为538 bp的序列，将结果经NCBI进行BLAST比对，其序列与Genbank库中登录的美澳型核果褐腐病菌的4个菌株的DNA序列（KM279616.1、FJ515894.1、FJ411109.1、EF207419.1）同源性为100%，进一步验证了分离得到的病原菌为美澳型核果褐腐病菌[Monilinia fructicola (Wint.) Honey]。

3 结论

本研究通过将待测序的片段插入克隆载体中，并获取含有待测片段的质粒后进行测序，进一步提高了测序结果的准确性。

美澳型核果褐腐病菌因其寄主范围广，易使果实受到侵害，特别是果实受到病菌的严重侵蚀且未进行有效防治时，可造成果园中大批量水果感染。又因其危害周期长，且对果实进行潜伏侵染，使得病菌在果实的储藏期随着孢子的不断繁殖形成大面积蔓延，从而造成持续扩散，水果在销售前将完全腐烂，失去商品价值，造成严重的经济损失。因美澳型核果褐腐病菌传染性强，波及范围广，已受到各国植物检疫领域研究人员的密切关注。我国口岸多次从进境旅客携带的苹果^[12]、樱桃^[13]、李子^[14]及进境贸易水果^[15]中截获该病原菌，而从进境桃中截获此病原菌尚属首次。

由于美澳型核果褐腐病菌入侵所带来的危害不可估量，有必要针对其开展形态学与分子生物学等方面的深入探究。因此，本研究为我国进境桃携带美澳型核果褐腐病菌的检疫与鉴定提供了理论依据。通过对美澳型核果褐腐病菌的研究，可以深入了解该病原菌的感染特点、入侵感染途径等，有助于对其进行有效检疫和密切监控，进而从根本上阻断该病原菌进一步侵害果木，防止其在我国境内传播与扩散。此外，对研究治愈病害方式方法具有指导意义，为抢救治疗已遭受病原菌侵害感染的果品提供理论支撑，并对我国境内没有感染病原菌的果木生长和发展起到保护作用，还可以为有效解决因进口水果所产生的贸易摩擦发挥积极作用，对我国非疫区水果生产销售具有重要意义。

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