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次氯酸消毒剂低温消毒效果试验观察
作者：胡 佳1 蔡慧玲1 赖翠玲2 李家祺1 苏锐芬2 廖如燕1*
摘 要 观察次氯酸消毒剂在低温下的消毒效果，并比较次氯酸低温消毒液与次氯酸常温消毒液在低温模拟现场条件下的消毒效果，为口岸冷链消毒工作提供依据。分别依据《低温消毒剂卫生安全评价技术要求》（国卫办监督函[2020]1062号）和《消毒技术规范》（卫生部2002年版），采用载体定量杀菌试验方法，对消毒剂进行低温实验室微生物杀灭试验、模拟现场试验。次氯酸低温消毒液原液在-5℃下，作用10 min，对大肠杆菌的杀灭对数值＞5.83、对金黄色葡萄球菌的杀灭对数值＞5.81、对脊髓灰质炎病毒的杀灭对数值＞5.22。在相同浓度防冻剂和-5℃条件下，作用时间10 min，次氯酸低温消毒液原液模拟现场试验消毒合格，而次氯酸常温消毒液原液模拟现场试验消毒不合格。含有抗冻剂的次氯酸消毒液在-5℃条件下，性状与常温一致；不含抗冻剂的次氯酸消毒液在-5℃条件下结冰。低温条件下，次氯酸低温消毒液能有效杀灭微生物，其消毒效果优于次氯酸常温消毒液，为确保次氯酸消毒剂在低温条件下的消毒效果，需要大幅提高有效氯含量以及延长作用时间。
胡 佳1 蔡慧玲1 赖翠玲2 李家祺1 苏锐芬2 廖如燕1*
次氯酸是一种弱酸性强氧化剂，属于含氯消毒剂的一种[1]，可用于物体表面消毒、皮肤消毒、空气消毒[2]。2020年新型冠状病毒(COVID-19)在国内外暴发时，含氯消毒剂被广泛用于物品、食品、环境、人体皮肤黏膜的消毒，是一种价格低廉、毒性较低、灭活微生物效率较高的消毒剂[3]。
《低温消毒剂卫生安全评价技术要求》（国卫办监督函[2020]1062号）[4]于2020年12月31日发布，文件中规定用于低温冷冻物品表面消毒的低温消毒剂，需要在低温条件下进行实验室微生物杀灭试验和模拟现场试验，代表菌株为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，代表毒株为脊髓灰质炎病毒。经查询全国消毒产品网上备案信息服务平台，大部分常温使用的次氯酸消毒液平均有效氯含量低于120 mg/L，本文按照卫健委文件规定项目，通过比较314 mg/L次氯酸低温消毒液和122 mg/L次氯酸常温消毒液在-5℃条件下的消毒效果，讨论低温对次氯酸消毒剂消毒效果的影响。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验用消毒剂
(1) 次氯酸低温消毒液，主要有效成分为次氯酸，有效氯含量为314 mg/L，含有防冻剂氯化钠。
(2)含有与低温消毒液相同浓度防冻剂的次氯酸常温消毒液，主要有效成分为次氯酸，有效氯含量为122 mg/L。
上述两款消毒液为同一企业生产，次氯酸常温消毒液在20℃下可有效杀灭微生物。
1.1.2 试验指标微生物
指标菌分别为大肠杆菌（8099）和金黄色葡萄球菌（ATCC6538），购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。毒株为脊髓灰质炎病毒I型（PV-I/sabin/2003）疫苗株，由国家脊灰实验室提供。
1.1.3 消毒器械
低温模拟现场消毒器械为全方位通道式消杀系统。
1.2 试验方法
1.2.1 染菌和染毒载体制备
(1)染菌载体的制备 依据卫生部《消毒技术规范》（2002年版）[5]2.1.1.2.4，实验室杀灭试验采用脱脂白平纹棉布片（1.0 cm×1.0 cm）为载体，低温模拟现场试验采用灭菌牛皮纸（5 cm×5 cm）为载体，含菌量均为5×105 cfu/cm2～5×106 cfu/cm2。用于低温试验的染菌载体于干燥后-5℃条件下放置30 min，备用。
(2)染毒载体的制备 依据卫生部《消毒技术规范》（2002年版）2.1.1.10.7，取病毒悬液滴染于载体上，所用载体同上。经测定载体平均病毒滴度（TCID50）的对数值在5～7之间，于37℃恒温箱中烘干。用于低温试验的染毒载体在干燥后-5℃条件下放置30 min，备用。
1.2.2 低温微生物杀灭试验
(1)细菌中和剂鉴定试验 依据卫生部《消毒技术规范》（2002年版）2.1.1.5.6，试验菌为大肠杆菌。试验用次氯酸低温消毒液1∶4稀释液，作用时间0.5 min，中和剂用TPS作相应倍数稀释。试验温度-5℃。试验重复3次。
(2)病毒中和剂鉴定试验 依据卫生部《消毒技术规范》（2002年版）2.1.1.10.5。用该消毒剂原液，作用时间1 min。试验温度-5℃，试验重复3次。
(3)实验室微生物杀灭试验 依据卫生部《消毒技术规范》（2002年版）2.1.1.7.5和2.1.1.10.7。试验用次氯酸低温消毒液原液，作用时间分别为5 min、10 min、15 min，试验温度-5℃。试验重复3次。
1.2.3 低温模拟现场试验
依据卫生部《消毒技术规范》（2002版）中2.1.2.9进行实验。将染菌载体分别固定于冷链货物纸箱的6个表面，放入-5℃冰柜。分别将两种试验用消毒剂原液置-5℃预冷后装入全方位通道式消杀系统的消毒液储存容器，按使用说明书开机预热，待气压与喷雾量稳定后，将冷链货物纸箱放至传输带上，让其通过该设备的消毒舱，通过传输带的时间为15 s（通过消毒舱的时间约为10 s）。过机后，静置消毒作用10 min，以无菌操作将冷链货物纸箱上的牛皮纸载体取下，置于含中和剂的采样液试管中，进行活菌培养计数，试验分别重复30次；同时将同批未过机的染菌牛皮纸作为对照组。
1.2.4 低温试验
将两种试验用消毒剂置于-5℃下过夜（＞8 h），观察其形状。
2 结果
2.1 低温微生物杀灭试验
2.1.1 细菌中和剂鉴定试验结果
在-5℃条件下，以5 g/L硫代硫酸钠、20 g/L吐温80的TPS溶液作为中和剂，可有效中和次氯酸低温消毒液中次氯酸对大肠杆菌的作用，且该中和剂及中和产物对试验菌及培养基无不良影响（见表1）。
2.1.2 病毒中和剂鉴定试验
在-5℃条件下，以10 g/L硫代硫酸钠的PBS溶液作为中和剂，可有效中和次氯酸物体表面消毒液中次氯酸对脊髓灰质炎病毒的作用，且该中和剂及中和产物对病毒及细胞无不良影响（见表2）。
表1 次氯酸低温消毒液在-5℃细菌中和剂鉴定试验结果
Table 1 Identification test result of bacteria neutralizer for low-temperature disinfectant at -5℃
组别 | 各组大肠杆菌平均回收菌数 (cfu/mL) |
1 | 4.72×102 |
2 | 2.00×103 |
3 | 6.17×105 |
4 | 5.77×105 |
5 | 6.47×105 |
6 | 0 |
注：阴性对照无菌生长。 | |
表2 次氯酸低温消毒液在-5℃病毒中和剂鉴定试验
Table 2 Identification test result of virus neutralizer for low-temperature disinfectant at -5℃
组别 | 各组病毒平均滴度 (TCID50) 对数值 |
1 | 细胞毒性 |
2 | 3.56 |
3 | 6.17 |
4 | 6.22 |
5 | 5.89 |
6 | 细胞生长良好 |
注：阴性对照细胞生长良好。 | |
2.1.3 实验室微生物杀灭试验
在-5℃条件下，次氯酸低温消毒液原液，作用时间10 min，对大肠杆菌的杀灭对数值＞5.83、对金黄色葡萄球菌的杀灭对数值＞5.81、对脊髓灰质炎病毒的杀灭对数值＞5.22（见表3）。
2.2 低温模拟现场试验
在-5℃条件下，经全方位通道式消杀系统加压喷雾消毒，作用10 min，次氯酸低温消毒液对冷链货物纸箱上染于牛皮纸上的大肠杆菌平均杀灭对数值为4.80，对染于牛皮纸上的金黄色葡萄球菌的平均杀灭对数值为3.80，杀灭对数值均＞3.00。次氯酸常温消毒液对冷链货物纸箱上染于牛皮纸上的大肠杆菌的平均杀灭对数值为2.52，对染于牛皮纸上的金黄色葡萄球菌的平均杀灭对数值为2.01，杀灭对数值均＜3.00（见表4）。
表3 次氯酸低温消毒液在-5℃对微生物的杀灭效果
Table 3 Killing effect of microorganism for low-temperature disinfectant at -5℃
试验菌株 | 作用不同时间的平均杀灭对数值及范围 | 阳性对照组对数值及范围 | ||
5 min | 10 min | 15 min | ||
大肠杆菌 | （＞5.80～＞5.87） | （＞5.80～＞5.87） | （＞5.80～＞5.87） | （5.80～5.87） |
金黄色葡萄球菌 | （＞5.75～＞5.87） | （＞5.75～＞5.87） | （＞5.75～＞5.87） | （5.75～5.87） |
脊髓灰质炎病毒 | （4.34～5.00） | （5.00～＞5.67） | （＞5.67～＞6.50） | （5.67～6.50） |
注：1. 阴性对照、稀释液、中和剂、培养基均无菌生长；2. 阴性对照稀释液对细胞生长无影响。 | ||||
表4 -5℃条件下不同含量次氯酸消毒液模拟现场结果
Table 4 Simulated field results of the effect of different contents of hypochlorous acid disinfectant at -5℃
消毒剂 | 作用时间 | 试验菌株 | 平均杀灭对数值 | 阳性对照组 (cfu/cm2) |
次氯酸低温消毒液 | 10 min | 大肠杆菌 | （3.42～6.77） | （1.06×106～1.27×106） |
金黄色葡萄球菌 | （3.03～4.92） | （9.58×105～1.18×106） | ||
次氯酸物体表面消毒液 | 10 min | 大肠杆菌 | （1.76～2.98） | （5.04×105～5.24×105） |
金黄色葡萄球菌 | （1.75～2.31） | （5.04×105～5.24×105） | ||
注：阴性对照组无菌生长。 | ||||
2.3 低温试验
含有抗冻剂的次氯酸消毒液在-5℃条件下，均保持液体状态、无析出、无结晶，性状与常温一致。不含抗冻剂的次氯酸消毒液在-5℃条件下结冰（见表5）。
表5 次氯酸消毒剂在-5℃条件下性状
Table 5 Properties of hypochlorous acid disinfectant at -5℃
消毒剂 | 性状 |
次氯酸低温消毒液 | 保持液体状态、无析出、无结晶 |
次氯酸常温消毒液（含抗冻剂） | 保持液体状态、无析出、无结晶 |
次氯酸常温消毒液 | 结冰 |
3 结论
次氯酸消毒剂是一种无色、透明、对人体无明显刺激性和异味的消毒剂[6]，主要通过次氯酸卤化或氧化细胞蛋白质和脂质而破坏病原体[7]。经查询全国消毒产品网上备案信息服务平台，大部分常温使用的次氯酸物体表面消毒液平均有效氯含量低于120 mg/L。本次试验用消毒液选用了同一企业生产的有效氯分别314 mg/L的次氯酸低温消毒液和122 mg/L的次氯酸常温消毒液，是为了保证选用的消毒剂工艺和配方相同，并且122 mg/L的有效氯含量可代表大部分常温使用的次氯酸消毒剂。
根据实验室微生物杀灭试验结果，次氯酸低温消毒液原液在-5℃条件下，作用10 min，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和脊髓灰质炎病毒均消毒合格。根据低温模拟现场试验，在-5℃条件下，作用时间均为10 min，有效氯含量为314 mg/L的次氯酸低温消毒液原液对冷链货物纸箱上染于牛皮纸上的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌消毒合格，可见次氯酸低温消毒液可在-5℃下能有效对微生物进行杀灭。而有效氯含量为122 mg/L的次氯酸常温消毒液对冷链货物纸箱上染于牛皮纸上的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌消毒不合格，可见常温消毒合格的次氯酸消毒液在-5℃条件下，由于温度降低会影响消毒效果，出现消毒不合格的情况。总的来说，低温条件下，次氯酸低温消毒液比次氯酸常温消毒液消毒效果好。低温试验结果也显示在不加防冻剂的情况下，次氯酸常温消毒液在-5℃低温条件下会结冰，不符合“用于冷冻物体表面消毒时，应采用降低冰点的方法，确保消毒时不结冰”[8]，消毒效果无法保证。
次氯酸消毒液低温模拟现场试验结果可见次氯酸消毒剂对微生物的杀灭效果受温度影响，在-5℃条件下，需要大幅提高有效氯含量，并且延长作用时间才可保证消毒效果。在海关口岸特别是对冷链货物消毒需要格外注意，需使用低温专用次氯酸消毒剂，并严格按消毒剂使用说明操作才能保证消毒效果。本次观察的次氯酸低温消毒液原液在-5℃条件下对微生物消毒试验均合格，因此在-5℃及以上低温条件下，此消毒液可以使用。
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参考文献
[1]林立旺，陈路瑶，章灿明,等. 新型冠状病毒防控中消毒剂的正确选择[J]. 中国消毒学杂志, 2020, 37(3): 226-229.
[2]李丹. 4种常用消毒剂应用浅析[J]. 《中国洗涤用品工业》消毒杀菌技术特刊, 2020, 3/4:253-256.
[3]赵凯丽. 酸性氧化电位水的杀菌机理及其氧化还原性研究[D].西安：第四军医大学, 2017:11-15.
[4]国卫办监督函[2020]1062号. 低温消毒剂卫生安全评价技术要求[S]. 北京：国家卫生健康委员会, 2020.
[5]中华人民共和国卫生部. 消毒技术规范[S]. 2002.
[6]高晓东，胡必杰，鲍容. 次氯酸消毒液对皮肤软组织感染常见病原体体外杀菌试验效果分析[J]. 中华医院感染学杂志，2017, 27(8): 1714-1716.
[7] Crew J, Varilla R, Rocas TA, et al. NeutroPhase(®) in chronic non-healing wounds[J]. Int J Burns Trauma, 2012, 2(3): 126-134.
[8]国务院应对新型冠状病毒肺炎疫情联防联控机制综合组. 冷链食品生产经营过程新冠病毒防控消毒技术指南[S]. 2020.
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