赵菊鹏1* 武目涛1 王章根2 李献锋1 胡学难1 马 骏1 梁 帆1

桔小实蝇是我国南方果蔬危害严重的害虫，也是世界各国严格防范的检疫性有害生物。为防止危害性实蝇传入本国，针对果蔬的进出口贸易，各国都制定了严格的检验检疫措施。早在1956年Balock 等^[1]就提出用⁶⁰Co γ射线杀灭桔小实蝇作为检疫处理方法。随着辐照处理技术在研究和应用方面逐步成熟以及熏蒸剂溴甲烷逐步退出，辐照也越来越广泛应用于新鲜水果和蔬菜检疫处理中。

γ射线是处理实蝇等害虫的有效措施，在推荐的有效剂量内，可以阻止正常成虫的产生，但不能阻止幼虫继续发育及化蛹。Balock 等^[2]；Komson^[3]；Jessup等^[4]研究表明实蝇类老熟幼虫比低龄幼虫对辐照的忍耐力强。150 Gy可以阻止实蝇3龄幼虫羽化为成虫 ^[5-6]。Zhao等^[7]用116 Gy处理10684头桔小实蝇的3龄幼虫，没有成虫羽化。当昆虫受到辐照时，产生电离辐射，导致生物体内的蛋白质、核酸和酶遭到破坏，严重者使细胞乃至生物体死亡。生物的辐照效应要在一定时间后才表现出来，有关辐照对昆虫体内酶影响的研究主要集中在酚氧化酶和酯酶同工酶方面^[8]。赵菊鹏等^[9]测定了辐照对桔小实蝇不同发育时期单条幼虫酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、乙酰胆碱酯酶（AChE）的OD值的变化。为进一步揭示辐照对昆虫生理生化的影响，我们以⁶⁰Coγ（160 Gy）射线辐照桔小实蝇的3龄末幼虫，测定其在辐照后体内酚氧化酶（PO）、羧酸酯酶（CarE）、乙酰胆碱酯酶（AChE）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）及过氧化物酶（POD）等主要酶系的变化，以期对辐照后桔小实蝇体内生理生化变化进行研究。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）采自广州郊区的番石榴果园，室内幼虫以人工饲料进行，成虫用新鲜橙片饲养，室内相对湿度为65±5%，温度为（25±1）℃，光周期12∶12；第4代幼虫用于本实验。

1.2 供试药剂

愈创木酚和邻苯二酚购自天津化学试剂公司；碘化硫代乙酰胆碱（Acetylthiocholine iodide, ATch）、毒扁豆碱（Eserine）和5，5′－二硫双硝基苯甲酸（5，5′－Dithiobis，DTNB）购自Fluka；醋酸-α-萘酯购自上海五联化工厂；曲拉通（Triton X-100）购自北京鼎国生物技术有限责任公司，由Genview分装；1%固蓝B盐购自上海国药集团；核黄素和L-甲硫氨酸（MET）购自上海伯奥生物科技有限公司；氯化硝基四氮唑蓝（NBT）购自上海前进化学试剂厂；其他试剂购自广州化学试剂厂。

1.3 辐照源

华南农业大学辐照中心⁶⁰CO源，源活度为6万居里；吸收剂量采用Fricke剂量计进行检测。

1.4 辐照处理

早上9:00～10:00采卵，取出放入恒温（27℃）恒湿（相对湿度75%）培养箱内培养至3龄期5日龄幼虫，到华南农业大学辐照中心用⁶⁰CO-γ射线辐照，辐照剂量为160Gy，辐照后继续放入恒温（27℃）恒湿（相对湿度65%±5%）人工气候箱内培养。按辐照后的不同时段采集对照和处理组的幼虫，以用于制备酶液，直到对照化蛹为止。每组处理每次取25头幼虫，每组重复3次。

1.5 酶提取和测定方法

1.5.1 酶液制备

PO、CarE、SOD、CAT的酶液提取方法参照张慧等^[10]的方法。

提取AChE酶液，用含0.3%曲拉通（W/V）预冷PBS液研磨，浓度为0.1 mol/L（pH为7.8），其他条件同PO、CarE、SOD、CAT的酶液提取方法。

1.5.2 SOD活性测定

参照NBT法^[11-12]进行。

1.5.3 CAT活性测定

参照张友军等^[13]方法。

1.5.4 POD活性测定

参照Simon等^[14]和张慧等^[10]方法。

1.5.5 PO活性测定

参照匡石滋和Benjamin、Montgomery等方法^[15-16]。

1.5.6 CarE活性测定

参照Van Asperen方法^[17]进行。

1.5.7 AChE活性测定

参照Gorun改进的Ellman方法^[18]。

1.5.8 蛋白质含量测定

参照考马斯亮蓝G-250法^[19]。

1.6 数据分析

试验数据分析采用Excel（MS Office 2013版）和DPS数据处理系统（Data Processing System）11.50专业版进行统计与分析。

2 结果与分析

160Gy辐照桔小实蝇5日龄幼虫后其体内酶活性变化：

2.1 辐照桔小实蝇5日龄幼虫后对其SOD活性的影响

由表1可知，正常桔小实蝇的SOD活性在发育过程中会有一些变化。本试验辐照时间为早上9:30～10:00，SOD酶活性随着昼夜的变化也表现出相应变化。在48 h内表现出日间活性低，夜间活性增强的昼夜规律。即在0 h、24 h、48 h酶活力无显著差异。随着幼虫逐渐发育，待化蛹时，SOD酶活性也随之降低，SOD酶活性变化可能与虫本身代谢相关。在60 h时酶活性最小为0.6264 OD₅₆₀·mg^-1·min^-1。

表1 辐照对桔小实蝇5日龄幼虫体内SOD活性

（OD₅₆₀·mg^-1·min^-1）影响

Table 1 Effects of irradiation on SOD activity

(OD₅₆₀·mg^-1·min^-1) of 5^th day larvae of Bactrocera dorsalis

注：表中数据为平均数±标准误。同行数据后不同字母表示在p＝0.05水平上存在差异（t测验）。

辐照后，虫体SOD活性变化基本遵循上述规律，但酶活力在12 h、24 h、36 h、48 h显著低于对照，在6 h、60 h时酶活性较对照显著升高，分别为对照的1.25倍、1.32倍。辐照后，酶活力显著被激活，12 h后酶活性又被抑制，在临近化蛹时酶活力又逐渐被激活。

2.2 辐照桔小实蝇5日龄幼虫后对其CAT活性的影响

由表2可知，对照组桔小实蝇幼虫的CAT酶在12 h活性最低，36 h活性最高。CAT酶活性随着虫体发育，逐渐降低。

表2 辐照对桔小实蝇5日龄幼虫后CAT活性

（OD₂₄₀·mg^-1·min^-1）影响

Table 2 Effects of irradiation on CAT activity

(OD₂₄₀·mg^-1·min^-1) of 5^th day larvae of Bactrocera dorsalis

注：表中数据为平均数±标准误。同行数据后不同字母表示在p＝0.05水平上存在差异（t测验）。

辐照后，CAT酶活的变化与对照差异不大，酶活最低点和最高点仍出现在12 h和36 h。酶活力在6 h时被显著激活，12 h～24 h虫体酶活性又被抑制，36 h酶活性又升高较对照高1.1499倍，48 h、60 h酶活性与对照差异不大。

2.3 辐照桔小实蝇5日龄幼虫后对其PO活性的影响

由表3可知，正常虫体PO活性有逐渐下降的趋势，酶活性早晚变化不大。酶活性最高出现在12 h，最低出现在60 h。

表3 辐照对桔小实蝇5日龄幼虫PO活性

（OD₄₂₀·mg^-1·min^-1）影响

Table 3 Effects of irradiation on PO activity (OD₄₂₀·mg^-1·min^-1) of 5^th day larvae of Bactrocera dorsalis

注：表中数据为平均数±标准误。同行数据后不同字母表示在p＝0.05水平上存在差异（t测验）。

辐照后，虫体的PO活性变化较大，总体来说酶活性辐照后较对照酶活性显著的降低。辐照6 h时酶活性显著高于对照，为对照的1.51倍。12 h时酶活性显著低于对照，为对照的38.64%。36 h酶活性较对照稍高，但差别不大。48 h、60 h酶活性较对照显著降低。

2.4 辐照桔小实蝇5日龄幼虫后对其CarE活性的影响

由表4可知，正常虫体的CarE酶活在36 h达到最高为5.5134 μmol·mg^-1·min^-1，24 h最低为2.5536 μmol·mg^-1·min^-1。酶活性在36 h后逐渐降低。

表4 辐照对桔小实蝇5日龄幼虫CarE活性

（μmol·mg^-1·min^-1）影响

Table 4 Effects of irradiation on CarE activity

(μmol·mg^-1·min^-1) of 5^th day larvae of Bactrocera dorsalis

注：表中数据为平均数±标准误。同行数据后不同字母表示在p＝0.05水平上存在差异（t测验）。

辐照后，虫体CarE酶活变化趋势基本不变。除12h酶活性显著低于对照，24 h、60 h酶活性显著高于对照外，其他时间点与对照无显著差异。

2.5 辐照桔小实蝇5日龄幼虫后对其AChE活性的影响

由表5可知，正常虫体的AChE酶活性0 h最高，60 h最低，表现出随时间延长，酶活性下降的趋势。

表5 辐照对桔小实蝇5日龄幼虫AChE活性

（OD₄₁₂·mg^-1·min^-1）影响

Table 5 Effect of irradiation on AChE activity

(OD₄₁₂·mg^-1·min^-1) of 5^th day larvae of Bactrocera dorsalis

注：表中数据为平均数±标准误。同行数据后不同字母表示在p＝0.05水平上存在差异（t测验）。

辐照后，24 h虫体AChE活性到达最高值，酶活的变化趋势与对照基本相同。辐照6 h时酶活性显著低于对照，为对照的57.9%。36 h时酶活性显著高于对照，为对照的1.32倍。其余时间点与对照差异不大。

2.6 辐照桔小实蝇3日龄3龄幼虫后对其过氧化物酶活性的影响

在正常和辐照后桔小实蝇幼虫体中，用1.5.3中的方法均未测出过氧化物酶的活性。

3 讨论

昆虫等生物体内的保护酶系由SOD、CAT及POD构成，该系统可消除昆虫体内过量的氧自由基，防止产生毒害^[20-21]。辐照与生物体作用的过程极其复杂，分为直接作用和间接作用。直接作用是生物体吸收射线继发电子直接对DNA分子产生作用，引起DNA损伤；间接作用是射线使水分子产生自由基HO·，HO·与DNA分子再发生作用，使DNA产生损伤^[22]。DNA分子的任何改变都会引起载体信息改变，导致细胞功能和繁殖发生变化。本研究结果表明，SOD、CAT在虫体内的变化趋势基本相同，过氧化物酶酶活性没测出。说明桔小实蝇体内的保护酶系是由SOD和CAT这两种酶组成，在虫体内一起协同作用消除细胞内的氧自由基。辐照6 h后，桔小实蝇体内的SOD、CAT酶活性均被诱导升高分别为对照的1.25倍、1.14倍。表明辐照后，体内的自由基HO·升高，诱导了SOD、CAT酶的活性。随后12 h、24 h和48 h，SOD酶和CAT酶活性均被抑制，导致体内的氢氧自由基增加，损伤了DNA分子。

昆虫不具有完整的免疫系统，它一般通过产生黑色素来抵御外来入侵物，而酚氧化酶是昆虫体内合成黑色素的关键酶类，对昆虫免疫反应起关键作用^[23]。同时PO还被认为是昆虫表皮蹂质化和硬化、以及伤口愈合和抵御病原生物时起重要作用的酶^[24]。辐照6 h后，桔小实蝇体内的PO酶活性被显著激活，为对照的1.51倍，12 h后又显著被抑制仅为对照的0.39，在24 h、48 h、60 h PPO的活性被显著抑制。结果表明辐照对桔小实蝇体内的PO影响显著。

CarE是昆虫体内重要的一种解毒代谢酶，本研究表明辐照后6 h、24 h、60 h，桔小实蝇幼虫体内的CarE活性升高，但12 h、48 h CarE活性又被显著抑制。AChE是神经系统中一种主要的酶，辐照后，桔小实蝇的AChE活性在6 h、12 h被显著抑制仅为对照的0.58、0.87。但24 h、36 h后酶活性又升高为对照的1.15、1.32倍。说明辐照后CarE和AChE活性变化是一个动态的过程。

然而，辐照在昆虫体内引起的反应及代谢非常复杂，仅靠测定SOD、CAT及POD等保护酶系统及PO、CarE和AChE酶活性的变化难以全面阐述其作用机理，有关辐照对昆虫体内其它酶系统及核酸的影响，都有待于进一步的研究。

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