3M ™ Petrifilm ™ 乳酸菌测试片的评价-中国口岸科学技术-2021年06期

3M ™ Petrifilm ™ 乳酸菌测试片的评价

作者：林杰1 郑晶1 徐珊1 柯璐1* 陈彬1 张温玲1 曾维杨1

摘要本文对3M™ Petrifilm™乳酸菌测试片在检测食品中乳酸菌的准确性和适用性进行了评估。以GB 4789.35-2016为参考方法，通过实验室内比较研究和实验室间的比对试验，证明3M™ Petrifilm™乳酸菌测试片和GB 4789.35-2016比较，检测结果无显著性差异，表明该测试片完全能够满足食品中乳酸菌检测的要求。

林杰1 郑晶1 徐珊1 柯璐1* 陈彬1 张温玲1 曾维杨1

Evaluation of 3M^TM Petrifilm^TM Lactic Acid Bacteria Count Plate

乳酸菌是指发酵糖类的主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌可以促进营养物质的吸收，有利于促进肠道益生菌的增殖，抑制有害菌的生长，维持机体胃肠道微生态平衡，改善人体免疫力和提高抵抗力，预防疾病等^[1-2]。乳酸菌广泛应用于食品发酵，对人们的身体健康具有保健功能^[1-3]。为保证乳酸菌发酵食品的质量，需要对其进行乳酸菌含量检测。乳酸菌的定量检测方法包括平板菌落计数法、免疫学方法、色差分析法、流式细胞术、分子生物学法、商品化测试片方法等^[4-6]。由于商品化测试片方法具有操作简便快速、节约人力物力的特点，得到越来越广泛的应用，也有不少相关产品^[7-12]。与GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》^[13]相比，3M™ Petrifilm™乳酸菌测试片的培养时间从72 h缩短至48 h，能更快出具结果，从而快速判定食品的安全性。为规范地使用测试片，根据SN/T 3266-2012《食品微生物检验方法确认技术规范》^[14]和SN/T 2775-2011《商品化食品检测试剂盒评价方法》^[15]的要求，对3M™ Petrifilm™乳酸菌测试片进行验证评价，评估其在食品中乳酸菌检测的准确性和适用性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株：婴儿双歧杆菌GDMCC1.207、德氏乳杆菌GDMCC1.155，均购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心。

试剂：MRS培养基，3M™ Petrifilm™快速菌落总数测试片。

1.2 仪器与设备

KD-TBC-300M电子天平（福州科迪电子技术有限公司）；Stomacher3500拍击式均质器（英国SEWARD）；恒温培养箱（德国BINDER）。

1.3 方法

1.3.1 标准菌株及菌悬液的制备

将标准菌株婴儿双歧杆菌GDMCC1.207、德氏乳杆菌GDMCC1.155分别复活后，混合接种于MRS肉汤中，36℃厌氧培养48～72 h备用。

1.3.2 两种方法对比线性和准确度

根据SN/T 3266-2012和SN/T 2775-2011的要求，选择5类16种样品进行试验^[10-12]，其中包含7种自然污染样品和9种人工污染样品。将1.3.1中的混合培养液以适当的比例稀释后，按高、中、低3个接种水平添加到样品中混匀制备成测试样品^[10-12]。每种样品同时按照3M™ Petrifilm™乳酸菌测试片方法和GB 4789.35-2016进行检测。

1.3.3 测试片耐变性

耐变性评价由以下3个步骤组成：(1)确定可能影响检测结果的因素；(2)对每种因素稍作改变；(3)采用合适的方法进行耐变性检验^{[10-11,14-15]}。对于乳酸菌检测而言，应选择培养温度和培养时间两个变量进行耐变性试验^[10-12]。

1.3.4 测试片批间变异

为验证测试片的稳定性，取3个不同批号测试片，对2个污染水平奶粉样品进行批间变异试验^[10-12]。

1.3.5 实验室间协同试验

选用牛奶样品，添加婴儿双歧杆菌GDMCC1.207和德氏乳杆菌GDMCC1.155的混合培养物，制备成高、中、低3个接种水平的冻干样品，发送至8家实验室进行协同试验^[10-12]。每个接种水平样品同时用乳酸菌测试片方法和GB 4789.35-2016进行测试。

2 结果和分析

2.1 线性和准确度

微生物学检测数据通常不是正态分布，为获得更加对称的分布，应将计数结果转化成对数形式^[10-12,14]，比较乳酸菌测试片方法与GB 4789.35-2016的一致性^[12,16]。自然污染样品结果^[10-12]见表1，人工污染样品^[10-12]结果见表2。

表1 用2种方法测试7种自然污染样品的结果^[10-12]

Table 1 Test results of 7 kinds of natural pollution samples by two methods^[10-12]

样品	测试次数	GB 4789.35-2016 (MRS厌氧培养)					乳酸菌测试片方法
样品	测试次数	Lg (测试结果) (n＝5)					Lg (测试结果) (n＝5)
雅培小安素	1	7.38	7.48	7.26	7.32	7.34	7.32	7.38	7.53	7.46	7.38
	2	7.79	7.74	7.84	7.92	7.82	7.93	7.79	7.75	7.74	7.85
	3	7.89	7.74	7.81	7.73	7.74	7.85	7.76	7.86	7.77	7.81
乳酸菌颗粒	1	10.18	10.15	10.23	10.26	10.20	10.20	10.23	10.20	10.18	10.20
	2	8.62	8.60	8.52	8.53	8.45	8.57	8.61	8.46	8.54	8.56
	3	9.61	9.72	9.57	9.66	9.69	9.65	9.71	9.74	9.59	9.67
光明酸奶	1	3.48	3.53	3.38	3.57	3.46	3.61	3.53	3.56	3.59	3.51
	2	3.48	3.45	3.56	3.45	3.43	3.40	3.61	3.43	3.52	3.57
	3	3.49	3.68	3.45	3.54	3.49	3.58	3.45	3.54	3.51	3.70
酸奶冰淇淋	1	8.79	8.69	8.67	8.65	8.72	8.63	8.71	8.76	8.77	8.67
	2	8.75	8.60	8.76	8.77	8.67	8.61	8.68	8.66	8.74	8.76
	3	8.45	8.40	8.40	8.46	8.54	8.57	8.34	8.46	8.36	8.43
蒙牛优益C	1	11.43	11.40	11.40	11.51	11.56	11.62	11.43	11.40	11.48	11.54
	2	12.05	12.01	12.15	12.09	12.08	12.12	12.09	12.20	12.08	12.16
	3	11.82	11.89	11.75	11.84	11.81	11.90	11.76	11.86	11.75	11.97
泡菜	1	4.78	4.79	4.91	4.86	4.92	4.99	4.91	4.89	4.96	4.85
	2	4.71	4.68	4.65	4.79	4.76	4.89	4.78	4.79	4.93	4.97
	3	4.85	4.85	4.79	4.83	4.74	4.92	4.89	4.96	4.94	4.84
腌制牛排	1	4.01	4.12	4.08	4.04	4.06	4.20	4.16	4.12	4.17	4.18
	2	3.84	3.81	3.78	3.84	3.74	3.90	3.94	3.99	3.86	3.95
	3	4.13	4.14	4.20	4.18	4.11	4.25	4.26	4.28	4.23	4.27

表2 用2种方法测试9种人工污染样品的结果^[10-12]

Table 2 Test results of 9 artificially contaminated samples by two methods^[10-12]

样品	添加水平	GB 4789.35-2016 (MRS厌氧培养)					乳酸菌测试片方法
样品	添加水平	Lg (测试结果) (n＝5)					Lg (测试结果) (n＝5)
鱼露	高	5.28	5.20	5.20	5.23	5.18	5.28	5.23	5.26	5.18	5.23
	中	4.23	4.20	4.28	4.26	4.23	4.26	4.26	4.20	4.23	4.18
	低	3.26	3.20	3.18	3.26	3.20	3.28	3.26	3.20	3.20	3.20
熏鲅鱼	高	4.57	4.46	4.34	4.40	4.61	4.62	4.61	4.46	4.70	4.36
	中	3.62	3.71	3.61	3.52	3.46	3.57	3.46	3.34	3.49	3.51
	低	2.36	2.41	2.67	2.72	2.61	2.36	2.63	2.43	2.53	2.57
泡凤爪	高	4.58	4.53	4.61	4.59	4.70	4.51	4.59	4.63	4.41	4.49
	中	3.60	3.56	3.48	3.63	3.45	3.49	3.53	3.56	3.51	3.45
	低	2.59	2.67	2.46	2.56	2.61	2.48	2.41	2.57	2.53	2.49
沙拉酱	高	4.60	4.51	4.51	4.59	4.36	4.67	4.41	4.49	4.58	4.48
	中	3.38	3.61	3.54	3.56	3.49	3.45	3.52	3.53	3.59	3.51
	低	2.58	2.57	2.49	2.43	2.51	2.54	2.51	2.56	2.48	2.60
奶油	高	4.81	4.82	4.95	4.91	4.90	4.83	4.89	4.94	4.91	4.90
	中	3.96	3.89	3.88	3.90	3.88	3.89	3.82	3.95	3.91	3.92
	低	2.85	2.89	2.95	2.94	2.91	2.90	2.91	2.96	2.84	2.88
奶酪	高	5.28	5.31	5.32	5.29	5.36	5.34	5.31	5.30	5.33	5.27
	中	4.32	4.30	4.29	4.28	4.35	4.33	4.31	4.34	4.30	4.32
	低	3.29	3.32	3.35	3.33	3.30	3.31	3.34	3.29	3.36	3.31
乌冬面	高	4.89	4.68	4.76	4.77	4.82	4.84	4.72	4.75	4.66	4.70
	中	3.66	3.76	3.70	3.79	3.82	3.72	3.79	3.85	3.63	3.71
	低	2.86	2.85	2.68	2.79	2.76	2.90	2.88	2.79	2.86	2.72
火腿	高	5.20	5.16	5.18	5.16	5.20	5.19	5.18	5.12	5.24	5.23
	中	4.22	4.24	4.22	4.20	4.21	4.16	4.15	4.18	4.12	4.17
	低	3.20	3.17	3.16	3.13	3.16	3.21	3.17	3.13	3.13	3.16
腌制鲐鱼	高	4.67	4.85	4.79	4.74	4.71	4.59	4.68	4.76	4.75	4.83
	中	3.65	3.72	3.81	3.79	3.76	3.71	3.72	3.58	3.79	3.81
	低	2.76	2.80	2.83	2.88	2.70	2.61	2.79	2.76	2.70	2.82

依据表2的测试结果得出线性方程和确定系数^[10-12,17]，结果见表3；方法的显著性^[10-12]结果见表4；方法的重复性^[10-12]结果见表5。

表3 9种人工污染样品的线性方程和确定系数^[10-12]

Table 3 Linear equations and correlation coefficients of 9 artificially contaminated samples^[10-12]

食品基质	线性方程	确定系数 (R²)
鱼露	y＝1.0012x－0.0017	0.9972
熏鲅鱼	y＝1.0391x－0.167	0.9579
泡凤爪	y＝0.9944x－0.0449	0.9844
沙拉酱	y＝0.9921x＋0.0403	0.9940
奶油	y＝1.0086x－0.0316	0.9961
奶酪	y＝0.9948x＋0.0277	0.9976
乌冬面	y＝0.9492x＋0.1859	0.9906
火腿	y＝1.0075x－0.0505	0.9973
腌制鲐鱼	y＝1.0058x－0.0591	0.9836

注：y——测试片法菌落数的对数值；x——参考方法菌落数的对数值。

表4 显著性分析结果^[10-12]

Table 4 Significance analysis results^[10-12]

食品基质	T值
雅培小安素	0.057
乳酸菌颗粒	0.031
光明酸奶	0.164
酸奶冰淇淋	0.218
蒙牛优益C	0.210
泡菜	1.117
腌制牛排	1.208
鱼露	0.013
熏鲅鱼	0.093
泡凤爪	0.206
沙拉酱	0.020
奶油	0.002
奶酪	0.015
乌冬面	0.015
火腿	0.058
腌制鲐鱼	0.122
T_0.05(15)＝2.131

表5 重复性分析结果^[10-12]

Table 5 Repeatability analysis results^[10-12]

基体	添加水平	平均值		标准偏差		相对标准偏差 (%)
基体	添加水平	Lg (GB 4789.35-2016)	Lg (测试片)	GB 4789.35-2016	测试片	GB 4789.35-2016	测试片
雅培小安素	1	7.36	7.42	0.0817	0.0819	1.11	1.10
	2	7.82	7.81	0.0657	0.0808	0.84	1.03
	3	7.78	7.81	0.0689	0.0459	0.89	0.59
乳酸菌颗粒	1	10.20	10.20	0.0430	0.0192	0.42	0.19
	2	8.54	8.55	0.0704	0.0548	0.82	0.64
	3	9.65	9.67	0.0620	0.0567	0.64	0.59
光明酸奶	1	3.48	3.56	0.0718	0.0435	2.06	1.22
	2	3.47	3.51	0.0500	0.0904	1.44	2.58
	3	3.53	3.56	0.0907	0.0943	2.57	2.65
酸奶冰淇淋	1	8.70	8.71	0.0542	0.0589	0.62	0.68
	2	8.71	8.69	0.0713	0.0584	0.82	0.67
	3	8.45	8.43	0.0601	0.0900	0.71	1.07
蒙牛优益C	1	11.46	11.49	0.0704	0.0903	0.61	0.79
	2	12.08	12.13	0.0513	0.0485	0.42	0.40
	3	11.82	11.85	0.0499	0.0950	0.42	0.80
泡菜	1	4.85	4.92	0.0690	0.0566	1.42	1.15
	2	4.72	4.87	0.0539	0.0853	1.14	1.75
	3	4.81	4.91	0.0457	0.0480	0.95	0.98
腌制牛排	1	4.06	4.17	0.0435	0.0300	1.07	0.72
	2	3.80	3.93	0.0421	0.0501	1.11	1.27
	3	4.15	4.26	0.0358	0.0205	0.86	0.48
鱼露	高	5.22	5.23	0.0387	0.0382	0.74	0.73
	中	4.24	4.22	0.0283	0.0342	0.67	0.81
	低	3.22	3.23	0.0351	0.0354	1.09	1.10
熏鲅鱼	高	4.48	4.55	0.1133	0.1366	2.53	3.00
	中	3.58	3.47	0.0958	0.0831	2.67	2.39
	低	2.56	2.51	0.1581	0.1086	6.19	4.33
泡凤爪	高	4.60	4.53	0.0614	0.0862	1.33	1.90
	中	3.54	3.51	0.0796	0.0414	2.25	1.18
	低	2.58	2.50	0.0776	0.0579	3.01	2.32
沙拉酱	高	4.51	4.53	0.0962	0.1002	2.13	2.21
	中	3.52	3.52	0.0878	0.0517	2.50	1.47
	低	2.52	2.54	0.0606	0.0481	2.41	1.90
奶油	高	4.88	4.89	0.0619	0.0432	1.27	0.88
	中	3.90	3.90	0.0346	0.0497	0.89	1.27
	低	2.91	2.90	0.0421	0.0464	1.45	1.60
奶酪	高	5.31	5.31	0.0294	0.0295	0.55	0.56
	中	4.31	4.32	0.0261	0.0189	0.61	0.44
	低	3.32	3.32	0.0237	0.0303	0.71	0.91
乌冬面	高	4.78	4.73	0.0782	0.0667	1.63	1.41
	中	3.75	3.74	0.0652	0.0818	1.74	2.19
	低	2.79	2.83	0.0729	0.0739	2.62	2.61
火腿	高	5.18	5.19	0.0215	0.0476	0.41	0.92
	中	4.22	4.16	0.0162	0.0209	0.38	0.50
	低	3.17	3.16	0.0236	0.0334	0.74	1.06
腌制鲐鱼	高	4.76	4.69	0.0762	0.0764	1.60	1.63
	中	3.94	3.72	0.0625	0.0901	1.67	2.42
	低	3.00	2.74	0.0663	0.0823	2.37	3.01

从表3可见，9种人工污染样品的确定系数均＞0.95，表4中16种样品T值均＜T_0.05(15)＝2.131，表明3M™ Petrifilm™乳酸菌测试片方法和GB 4789.35-2016无显著性差异^[10-12]。从表5可见，GB 4789.35-2016和乳酸菌测试片方法的标准偏差通过SPSS工具进行显著性分析，结果P＝0.916＞0.05，说明无显著差异，表明3M™ Petrifilm™乳酸菌测试片方法准确度高^[10-12]。

2.2 测试片耐变性

经验证试验，培养温度选择35℃和37℃，培养时间选择45 h和51 h，对检测结果的标准偏差Sr通过SPSS工具进行显著性分析，结果P＝1.000＞0.05，说明无显著差异^[10-12]，表明在培养温度(36±1)℃和培养时间(48±3) h的范围内乳酸菌测试片性能稳定、准确度高。两种变量耐变性结果见表6。

2.3 测试片批间变异

3个不同批号测试片测试结果的标准偏差Sr通过SPSS工具进行显著性分析，结果P＝1.000＞0.05，说明无显著差异，表明乳酸菌测试片性能稳定^[10-12^]。批间变异结果见表7。

2.4 实验室间协同试验

2种方法测试结果的重复性值r和再现性值R比较接近，表明2种测试方法无显著差异^[10-12,18]。协同实验室内重复性分析结果^[10-12]见表8，协同实验室间重复性和再现性结果^[10-12]见表9。

表6 耐变性试验及分析结果^[10-12]

Table 6 Denaturation resistance test and analysis results^[10-12]

实验条件	菌株添加水平	测试结果（Lg值）					平均值	Sr	RSD (%)
实验条件	菌株添加水平	1	2	3	4	5	平均值	Sr	RSD (%)
37℃，51 h	高	3.52	3.57	3.62	3.54	3.41	3.53	0.0769	2.18
37℃，51 h	低	2.43	2.46	2.58	2.69	2.61	2.56	0.1073	4.20
37℃，45 h	高	3.36	3.48	3.56	3.65	3.61	3.53	0.1160	3.28
37℃，45 h	低	2.49	2.57	2.61	2.62	2.41	2.54	0.0880	3.46
35℃，51 h	高	3.66	6.53	3.45	3.43	3.52	3.52	0.0917	2.61
35℃，51 h	低	2.38	2.45	2.57	2.59	2.54	2.51	0.0892	3.56
35℃，45 h	高	3.36	3.46	3.61	3.58	3.56	3.51	0.1021	2.91
35℃，45 h	低	2.65	2.62	2.48	2.51	2.56	2.56	0.0751	2.93

表7 批间变异试验及分析结果^[10-12]

Table 7 Inter batch variation test and analysis results^[10-12]

菌株浓度	批号	测定结果（Lg值）					平均值	标准偏差	相对标准偏差 (%)
菌株浓度	批号	1	2	3	4	5	平均值	标准偏差	相对标准偏差 (%)
高	339A9T	3.56	3.54	3.61	3.68	3.63	3.61	0.0565	1.57
	339AL9	3.62	3.66	3.52	3.56	3.58	3.59	0.0564	1.57
	337YJE	3.58	3.57	3.61	3.63	3.56	3.59	0.0321	0.89
	总平均值		3.59		总Sr		0.1450
低	339A9T	2.52	2.63	2.61	2.65	2.63	2.61	0.0533	2.04
	339AL9	2.57	2.59	2.51	2.66	2.67	2.60	0.0693	2.67
	337YJE	2.68	2.66	2.54	2.61	2.58	2.62	0.0569	2.17
	总平均值		2.61		总Sr		0.1795

表8 协同实验室内重复性分析结果^[12]

Table 8 Repeatability analysis results in collaborative laboratories^[12]

协同实验室	添加水平	平均值		标准偏差		相对标准偏差 (%)
协同实验室		Lg (GB 4789.35-2016)	Lg (乳酸菌测试片)	GB 4789.35-2016	乳酸菌测试片	GB 4789.35-2016	乳酸菌测试片
实验室1	高	4.57	4.54	0.04	0.05	0.83	1.02
	中	3.57	3.52	0.06	0.02	1.66	0.56
	低	2.60	2.63	0.09	0.10	3.42	3.95
实验室2	高	4.54	4.52	0.03	0.06	0.74	1.29
	中	3.56	3.60	0.07	0.14	1.91	3.87
	低	2.55	2.55	0.06	0.11	2.30	4.32
实验室3	高	4.57	4.60	0.02	0.05	0.38	1.13
	中	3.57	3.56	0.07	0.09	1.96	2.58
	低	2.56	2.58	0.08	0.10	2.95	3.71
实验室4	高	4.59	4.58	0.06	0.04	1.31	0.86
	中	3.55	3.54	0.04	0.05	1.25	1.39
	低	2.63	2.52	0.03	0.13	1.13	5.02
实验室5	高	4.48	4.52	0.03	0.03	0.64	0.74
	中	3.50	3.57	0.06	0.05	1.58	1.28
	低	2.49	2.60	0.04	0.10	1.43	3.98
实验室6	高	4.57	4.74	0.05	0.05	1.03	1.15
	中	3.59	3.67	0.07	0.03	1.97	0.94
	低	2.58	2.64	0.09	0.07	3.45	2.48
实验室7	高	4.51	4.53	0.04	0.04	0.86	0.85
	中	3.58	3.51	0.05	0.03	1.29	0.79
	低	2.47	2.58	0.10	0.07	4.06	2.07
实验室8	高	4.53	4.53	0.06	0.06	1.32	1.34
	中	3.52	3.53	0.03	0.05	0.81	1.36
	低	2.54	2.59	0.05	0.10	2.10	3.73
注：实验室1代表中国海关科学技术研究中心；实验室2代表郑州海关技术中心；实验室3代表广州海关技术中心；实验室4代表厦门海关技术中心；实验室5代表福建中检华日食品安全检测有限公司；实验室6代表上海海关动植物与食品检验检疫技术中心；实验室7代表天津海关动植物与食品检测中心；实验室8代表长春海关技术中心

表9 协同实验室间重复性和再现性结果^[10-12]

Table 9 The results of repeatability and reproducibility between collaborative laboratories^[10-12]

添加水平	实验室数	乳酸菌测试片法		GB 4789.35-2016
添加水平	实验室数	r	R	r	R
高	8	0.129	0.266	0.111	0.184
中	8	0.187	0.285	0.164	0.233
低	8	0.268	0.373	0.215	0.314

3 结论

3M^TM Petrifilm^TM 乳酸菌测试片是一种预先制备好的培养基系统，包含培养基、选择剂、冷水可溶性凝胶剂和可增强菌落计数效果的四唑指示剂，菌落在测试片上呈红色，易于辨识。测试片含有氧清除化合物，可形成一种利于同型发酵与异型发酵乳酸菌再生恢复的厌氧环境，因此，只需要在有氧环境下培养(48±3) h进行菌落计数，不需要配备厌氧装置。相比GB 4789.35-2016，测试片方法所需设备少，操作简便，培养时间短。如果空间是实验室的一个特定因素，那么3M^TM Petrifilm^TM 乳酸菌测试片尺寸小且可堆叠被证明是一个优势。米糊状态的样品因为黏性强，无法在测试片上扩散，因此无法用乳酸菌测试片进行乳酸菌检测。另外，含红色色素的样品因为基质和红色菌落在计数时不易分辨，可以用带滤膜的均质袋过滤后检测，提高计数准确度。

通过2种检测方法的实验室间和实验室内的比对试验，均确证3M^TM Petrifilm^TM乳酸菌测试片和GB 4789.35-2016在食品检测上无显著性差异^[10-12]。3M^TM Petrifilm^TM 乳酸菌测试片方法检测结果准确度高，产品稳定性好，能满足食品中乳酸菌的检测要求^[10-12]。

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