卓训妮1

关键词 侧流免疫层析法；新型冠状病毒；新型冠状病毒肺炎；诊断

Development of Lateral Flow Immunoassay for the Diagnosis of COVID-19

ZHUO Xun-Ni¹

Abstract The technology of Lateral flow immunoassay (LFIA) is widely used in disease diagnosis, port quarantine, environmental monitoring and other fields because of its simplicity and rapidity. With the presenceof new markers and detection equipments, LFIA is developing from low sensitivity to high sensitivity, from qualitative to both quantitative and intelligent in recent years. Since the outbreak of COVID-19, LFIA and other methods have been applied to the detection of SARS-CoV-2. In this paper, the application and research progress of LFIA technology in the diagnosis of COVID-19 are summarized, which can be used as a reference for laboratory or correlative persons.

Keywords lateral flow immunoassay; SARS-CoV-2; COVID-19; diagnosis

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的急性呼吸道传染病，截至2021年6月25日，疫情已造成全球1.79亿人感染、389万人死亡^[1]。为及时诊断和救治患者，隔离密切接触者，全球已经开发了各类检测试剂应用到COVID-19诊断中。随着病毒的广泛传播以及疫苗接种，抗体检测显得日益重要，不仅有助于了解SARS-CoV-2 感染的抗体反应特征，还有助于了解感染范围和个体所获得的免疫力^[2-4]。此外，针对SARS-CoV-2的总抗体被认为是最敏感和最早的血清学标志物，被世界卫生组织（WHO）推荐为 COVID-19的诊断标准之一^[5]。目前，用于检测SARS-CoV-2总抗体、IgM和IgG的主要方法有酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）^[6]、侧流免疫层析法（Lateral flow immunoassay, LFIA）^[7]和化学发光免疫测定（Chemiluminescent immunoassay, CLIA）^[8]。在上述方法中，LFIA因其简便、快捷而引起越来越多使用者的关注^[9]，用于检测SARS-CoV-2感染的基于胶体金纳米颗粒标记^[10-12]等多种免疫层析技术在短时间内得到快速发展，因此，本文简要归纳总结了LFIA技术在COVID-19诊断中的应用研究进展。

1 LFIA技术

LFIA技术由Beggs等^[13]最早开发。LFIA的基本原理是将特异的抗体（抗原）预先包被在硝酸纤维素（NC）膜的某一区带，测定时，样品通过毛细作用沿着NC膜向前移动，当到达包被有抗体（抗原）区带时，样品中相应的抗原（抗体）与NC膜上的抗体（抗原）特异结合，形成免疫复合物，反应完毕，根据不同标记物采用目测或检测仪器判读结果^[14]。

LFIA技术可分为夹心法和竞争法。夹心法用于检测具有高分子量（HMW）的待测物，其中，包含数个抗原决定簇，如果在测试区出现一条颜色线，则结果为阳性，不出现颜色线为阴性^[15-17]。女性早孕诊断试纸条采用的就是夹心法^[18]。竞争法用于检测具有单个抗原位点的低分子量（LMW）待测物，在这个方法中，待测物的抗原会阻断测试线上的抗体，防止它们与偶联标记物发生相互作用，因此，当测试区出现颜色线时，结果为阴性；反之，结果为阳性^[19]。竞争法的灵敏度为ng/mL，夹心法的灵敏度更高，可达pg/mL。但当分析物处在高浓度时，夹心法可能会因高剂量效应而呈假阴性结果，而竞争法没有这个缺点^[18-19]。

LFIA的特点是简单、快速、直观，目前共有超过1000种免疫层析测试系统用于各种分析物的定性检验^[20]。近年来，LFIA技术发展迅速，改进了硝酸纤维膜，开发了碳纳米管、量子点、镧系元素、纳米酶、超顺磁性纳米粒子等新型标记物，其灵敏度比传统的胶体金更高、稳定性更好。例如：用半导体纳米材料量子点作为荧光标记物，其检测限可低至5.8 ng/mL；用超顺磁性纳米粒子（SMNP）和巨磁阻（GMR）传感器组成LFIA系统，可同时定量检测抗SARS-CoV-2的 IgM和IgG，最低检出限（LOD）分别达到10 ng/mL和5 ng/mL^[21-22]。此外，科技人员研发了光热成像、荧光、智能手机等多种新型检测仪，克服了早期免疫层析检测仪对灰度图像分析不充分的缺点，提升了信号处理能力，提高了灵敏度和准确度，并朝着智能化发展^[21]。

2 SARS-CoV-2病原及免疫学特点

SARS-CoV-2属于β属冠状病毒，呈球形或椭圆形，直径60～140 nm，具有5个必须基因，分别编码刺突蛋白（S）、基质蛋白（M）、病毒包膜（E）、核蛋白（N）和RNA聚合酶（RdRp），其中，核蛋白（N）包裹RNA基因组形成核衣壳，外层围绕病毒包膜（E），病毒包膜包埋基质蛋白（M）和刺突蛋白（S），刺突蛋白（S）通过结合血管紧张素转化酶2（ACE-2）进入细胞^[23]。SARS-CoV-2感染人体后，首先在呼吸系统中增殖，经过一段时间后（通常为 7～10 d），身体会产生针对病毒的特异性抗体，IgM 抗体首先出现，然后是 IgG 抗体^[24]。感染者在症状发作后第3周IgM水平达到峰值，在感染的第4周迅速下降；IgG在感染的第3周达到峰值，与IgM不同，感染者体内的IgG水平一直保持较高水平，直到感染第6周^[25]。检测COVID-19最常用的生物标志物是S和N蛋白^[26]。S蛋白可用作中和免疫测定^[27]以及即时检验（POCT）的靶标^[28]。

3 LFIA技术在COVID-19诊断中的应用

3.1 胶体金免疫层析

以胶体金为标记的免疫层析技术是传统经典的方法，目前仍被普遍采用，在11种中国产的SARS-CoV-2抗原抗体快速检测试剂中，8种是胶体金的试剂^[29]。Li等^[10]采用40 nm金纳米粒子（AuNPs）开发了一种即时检验的LFIA，可以在15 min内同时检测人血中SARS-CoV-2的IgM和IgG，其灵敏度为88.66%，特异性为90.63%。Zhou等^[30]针对20～40 nm胶体金纳米粒子（AuNPs）亮度不足、灵敏度相对较低的缺点，提出了聚乙烯亚胺（PEI）辅助的铜原位生长（CISG）作为受控信号放大策略，以提高基于金纳米颗粒的横向流动传感器（AuNP-LFS）的灵敏度，开发了用于改进SARS-CoV-2感染诊断的PEI-CISG增强条。研发者使用传统AuNP-LFS试纸条对69份SARS-CoV-2阳性血液标本和63份阴性标本进行性能测试，灵敏度为89.9%，特异性为100%，经PEI-CISG增强后，所有7个假阴性样本均成功地检测为阳性，灵敏度达100%，表明该扩增技术可以提高试剂对低目标浓度样品的响应能力，从而降低假阴性率，提高检测的准确性。

3.2 量子点标记免疫层析

量子点（Quantum dots, QDs），又称荧光半导体纳米颗粒，用于合成标记物，常见有硫化锌（ZnS）、硒化镉（CdSe）等化合物。最近的研究表明，使用具有高发光强度的荧光材料作为AuNP的替代标记物，有利于提高分析灵敏度^[31-32]。作为一种新型荧光纳米材料，量子点纳米珠（QB）基于高发光性和抗基质干扰性，在LFIA增强目标检测方面具有巨大潜力^[33-34]。Zhou等^[35]设计并开发了一种基于QB的LFIA（QB-LFIA），用量子点嵌入聚合物基质中制备了高发光QB，将其用作LFIA 的信号放大标记，与重组SARS-CoV-2的S蛋白共价连接后，采用双抗原夹心法测定人血清中的总抗体水平。应用QB-LFIA法可以在15 min内完成SARS-CoV-2总抗体的检测，与传统的胶体金LFIA 相比，分析灵敏度提高约1个数量级，其灵敏度为97.1%（67/69），特异性为100%（53/53）。Wang等^[36]设计并合成了新型比色荧光双模SiO₂@Au@QD NBs量子点纳米珠作为LFIA条带的多功能标记物，用于同时检测SARS-CoV-2特异性IgM和IgG，该方法仅需1 μL血清样品，15 min即可完成测试，灵敏度比胶体金LFIA高100倍。其研发的生物传感器有2种检测模式：一种是无需任何特殊仪器即可快速筛查疑似SARS-CoV-2感染患者的比色模式；另一种是用于定量分析以确定人体特定IgM和IgG浓度的荧光模式。研发者使用来自COVID-19患者的16个阳性血清样本和来自其他病毒性呼吸道感染患者的41个阴性样本进行方法验证，结果显示，该方法的灵敏度和特异性均达到100%。

3.3 纳米磁珠标记免疫层析

含有磁性材料如磁铁矿（Fe₃O₄）的纳米颗粒具有生物和化学惰性，可作为成像和分离剂^[37]。Bayin等^[22]开发了一种基于超顺磁性纳米粒子（SMNP）和巨磁阻（GMR）传感系统的LFIA方法（夹心法），用于同时定量检测抗SARS-CoV-2的IgM和IgG，能够在10 min内得出结果，IgM和IgG的LOD分别为10 ng/mL和5 ng/mL。另外，GMR平台支持医疗物联网，可以通过蓝牙协议将医疗数据传输到智能手机，为医务人员提供患者信息。

3.4 镧系元素标记免疫层析

镧系元素螯合物具有出色的荧光特性，包括出色的光稳定性、长发射波长、长荧光寿命、更大的Stokes位移和窄发射带，这些特性允许螯合物与背景自发荧光有选择地区别开来，通过时间分辨实现显著的信号放大。铕（Ⅲ）螯合染色微粒修饰的羧酸基团在这些测定中表现出良好的性能，因为它们可以与蛋白质共价结合，增加荧光标记的稳定性并减少干扰，与传统的荧光标记相比，具有更高的分析灵敏度和更大的检测范围^[38]。Chen等^[7]开发了一种基于镧系元素掺杂的聚苯乙烯纳米粒子（LNP）的LFIA法，用于检测抗SARS-CoV-2的IgG，将SARS-CoV-2的重组核衣壳磷蛋白分配到硝酸纤维素膜上以捕获特定的IgG，小鼠抗人IgG抗体用自组装LNP标记，作为荧光报告基团。用100 μL 1∶1000 稀释的血清样品进行测定，整个检测过程10 min。用51份正常血清和7份阳性血清验证该方法的准确性，实验结果符合临床诊断试剂要求。

3.5 荧光乳胶标记免疫层析

荧光乳胶粒子受激发光源激发而发出荧光，粒度均一，分散性好，而且稳定^[39]。Zhang等^[40]基于双抗体夹心原理，结合荧光微球标记技术和免疫层析技术研制了一种SARS-CoV-2抗原快速检测试纸。该试纸的检测限为100 ng/mL，活化的SARS-CoV-2病毒为1×10³ TCID₅₀/mL，其特异性在健康对照和其他呼吸道疾病患者中分别为100%和97.29%，灵敏度在COVID-19进展期和治愈期患者中分别为67.15%和7.02%，与RNA检测的阳性一致百分比和阴性一致百分比分别为83.16%和94.45%。

3.6 上转磷光标记免疫层析

上转磷光颗粒（Up-converting phosphor, UCP）是一种含稀土的晶体颗粒，具有独特的上转换现象，即可以被低能红外光激发并发出高能可见光。UCPs 产生足够大的反Stokes位移，导致发射和激发带分离良好，并且不会褪色，不同颜色的UCPs可以用相同的发射光谱同时激发。这些独特的光学特性使UCP成为理想的标记，UCP-LFIA 分析具有定量检测、高灵敏度和高稳定性的潜力，允许重复分析^[41]。北京热景生物科技有限公司采用该技术研制出检测SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体的UCP-LFIA试纸条，15～20 min可出结果^[29]。

3.7 LFIA商业试剂种类及性能

3.7.1 抗原检测

SARS-CoV-2抗原检测方法主要有胶体金和荧光LFIA法，使用鼻咽拭子样品检测，10～15 min出结果。Quidel公司开发了一种流感＋SARS抗原多重荧光LFIA检测试剂，15 min内可同时检出SARS-CoV-2、甲型和乙型流感病毒，LOD为4.17×10⁵ TCID₅₀/mL^[42]。

3.7.2 IgM/IgG抗体检测

获国家药品监督管理局批准的11种用于检测SARS-CoV-2 IgM/IgG抗体的国产LFIA试剂中包括4种标记方法：胶体金、基于稀土材料的纳米荧光、量子点荧光和上转换荧光，使用血清和血浆样品，15 min内出结果^[29]。各公司试剂的性能有一定差异，IgM试剂的灵敏度介于85%～87.9%，特异性介于96%～100%；IgG试剂的灵敏度介于97.2%～100%，特异性介于98%～100%；IgM和IgG混合抗体检测试剂的灵敏度介于86.43%～93.8%，特异性介于95.3%～99.57% ^[29,43]。

4 结语

综上所述，针对SARS-CoV-2抗原抗体的检测，一些公司已开发了基于胶体金、纳米磁珠、量子点、荧光乳胶、上转磷光和镧系元素标记的LFIA检测试剂。这些试剂均在10～20 min内即可完成检测，部分试剂的灵敏度和特异性达到100%，IgM和IgG的LOD分别达到10 ng/mL和5 ng/mL，表现出良好的性能，在新冠肺炎筛查中得到广泛应用。但同时也可以看到，大部分试剂的灵敏度和特异性未达到100%，部分样品由此将导致假阳性和假阴性结果，而假阴性结果将造成传染病潜在传播风险。因此，在实际应用中，应根据疾病发展的不同阶段以及抗原抗体在体内的变化规律选用相应的检测试剂。例如：在感染早期采用抗原试剂、IgM试剂，在感染后期采用IgG试剂，或者在感染不同阶段采用混合抗体试剂才能获得可靠的结果。此外，使用第三方质控品进行质量控制是获得准确结果的重要保证。

LFIA技术自开创以来，因其简便、快速的优点已广泛应用到生物医学、疾病诊断、口岸检疫等多个领域，传统的LFIA技术以目测检测线和控制线来判断定性结果，由于存在个人主观差异可能出现误判。随着新型标记物、检测设备、物联网和人工智能的开发和应用，LFIA技术将朝着更高灵敏度、数字化和智能化发展，使结果判读更加便捷、客观，检测结果更加准确可靠。

作者简介：卓训妮（1979—），女，汉族，广西玉林人，本科，主管技师，主要从事病原微生物检验工作，E-mail: 445602516@qq.com

1.广西壮族自治区钦州市疾病预防控制中心 钦州 535000

1. Qinzhou Center for Disease Control and prevention, Guangxi Zhuang Autonomous Region, Qinzhou 535000

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