尹 羿1 汪 琳1 高志强1 任 彤1 蒲 静1 赵相鹏1 张 伟1 白子龙1

摘 要 建立同时鉴别检测幼发拉底斑鳖和斑鳖的双重荧光PCR方法。通过对鳖科动物细胞色素ｂ基因序列比对，针对幼发拉底斑鳖和斑鳖，设计合成通用引物和特异性鉴别探针，经反应体系和反应参数优化，建立了快速检测鉴定幼发拉底斑鳖和斑鳖成分的 TaqMan双重荧光PCR方法。特异性试验结果显示，建立的方法可以快速、准确地鉴定幼发拉底斑鳖和斑鳖，与白唇泥龟、大麝香龟、巴西红耳龟、窄桥麝香龟、东北鳖以及豹纹陆龟等6种龟鳖目动物无交叉反应。分析灵敏度试验结果显示，对内含目的基因的重组质粒，检测下限均可达到10 copies/μL，能够满足龟鳖产品检测对灵敏度的需求。对58份口岸送检的龟鳖目动物样本进行检测，检出幼发拉底斑鳖样品1份，与普通PCR测序结果一致。本研究建立的双重荧光定量PCR方法灵敏、特异，重复性好，可快速准确鉴定斑鳖属动物及其制品，本方法为口岸濒危动物及其产品快速鉴定提供了新的可靠方法。

关键词 斑鳖；幼发拉底斑鳖；双重荧光PCR；TaqMan探针

Development of a Duplex Real-time PCR for Rapid Identification of Rafetus euphraticus and Rafetus swinhoei

YIN Yi¹ WANG Lin¹ GAO Zhi-Qiang¹ REN Tong¹ PU Jing¹

ZHAO Xiang-Peng¹ ZHANG Wei¹ BAI Zi-Long¹

Abstract This study aims at establishing a duplex real-time PCR for simultaneous detection of Rafetus euphraticus and Rafetus swinhoei. Based on sequence alignment of the cytochrome b gene of members of Family Trionychidae, a universal primer and a specific identification probe were designed and synthesized for R.euphraticus and R. swinhoei respectively. By optimizing the reaction system and conditions, a TaqMan duplex real-time PCR was established for rapid detection and identification of components of R.euphraticus and R. swinhoei. The results of specificity test showed that the established method could identify R.euphraticus and R. swinhoei quickly and accurately, and had no cross reaction with the DNA of six species of Tesudines, such as Kinosternon scorpioides albogulare, Staurotypus triporcatus, Trachemys scripta elegans, Claudius angustatus isolate, Pelodiscus maackii and Stigmochelys pardalis. The analytical sensitivity test showed that the lower detection limit could reach 10 copies/μL for the recombinant plasmid containing target gene, which could meet the sensitivity requirement for the detection of Turtle products. A total of 58 samples from the products seized at the port of entry were tested with 1 positive result for R.euphraticus, which is consistent with the sequencing results of PCR products, indicating the practicability of the method. The duplex real-time PCR established in this study is sensitive and specific with good repeatability, which can quickly and accurately identify the Rafetus and their products. The established method provides a new and reliable tool for the rapid identification of endangered animals and their products at ports.

Keywords Rafetus swinhoei; Rafetus euphraticus; duplex real-time PCR; TaqMan probe

基金项目：海关总署科研项目（2019HK027）

第一作者：尹羿（1986—），女，汉族，北京人，硕士，兽医师，从事进出口动物检疫工作，E-mail: 172925975@qq.com

1.中国海关科学技术研究中心 北京 100032

1. China Customs Science and Technology Research Center, Beijing 100032

鳖科（Family Trionychidae）斑鳖属^[1]（Genus Rafetus）现仅存两个物种，即幼发拉底斑鳖（Rafetus euphraticus）和斑鳖（Rafetus swinhoei），其中斑鳖又称黄斑巨鳖^[2]。目前，这两个物种在世界上的数量均十分稀少^[1]。幼发拉底斑鳖是土耳其东南部、叙利亚东北部、伊拉克和伊朗西南部的底格里斯河和幼发拉底河及其支流特有的一种鳖类，因原生地水质污染、人为猎杀以及缺乏有效保护等原因，导致该物种数量急剧减少，已被列入CITES附录II中，同时也是IUCN红色名录中濒危物种，其国际贸易受到管制。斑鳖主要分布在我国境内^[3]，是世界上最大的鳖类之一，同样已被列为CITES附录II中，是IUCN红色名录中极度濒危物种，也属于国际贸易受管制物种。

为了加强对野生动物的保护，各国都制定了相应的野生动物保护法规，禁止和买卖濒危动物。1973年，在美国华盛顿签署了《濒危野生动植物种国际贸易公约（CITES）》，中国于1981 年也加入该公约。尽管公约有160个成员国之多，但野生动物被偷猎和走私活动仍非常猖獗，继续威胁着世界各地野生动物的生存。在我国素有对“甲鱼”药食兼备的传统民俗，随着经济水平的提高，不计其数的龟鳖被制成药酒或晒干进而高价出售，这种旺盛的市场需求极大地刺激了龟鳖的非法贸易。海关作为执法机构在处理野生龟鳖动物走私案件过程中，首先要进行的就是物种鉴定。传统形态学对形态完整的个体可以进行鉴定，但对形态缺失或相关制品却无能为力。而国际间监管、执法的难度让保护力量显得过于苍白。为了更加有效加强龟鳖保护工作，遏制对龟鳖的非法狩猎和龟鳖制品的走私活动，建立一系列快捷准确的龟鳖制品检测方法迫在眉睫。本研究建立了特异性检测斑鳖属动物及其产品的TaqMan荧光PCR方法，并对该方法进行了初步应用研究，取得满意效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

本次实验所用样品有白唇泥龟、大麝香龟、巴西红耳龟、窄桥麝香龟、东北鳖、豹纹陆龟，以及猪、鸡、牛、马、羊等组织样品，样品均为检疫截获或贸易检疫留存样本，实验室保存。

1.1.2 主要试剂和设备

基因组 DNA 提取试剂盒（DP304），购自天根生化科技有限公司； Ex Taq DNA聚合酶，DL2000 Marker，均购自TaKaRa公司；AB 9700普通PCR仪，AB 7900，7500实时荧光 PCR仪，均为赛默飞公司产品，微量核酸浓度测定仪，TECAN公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物、探针的设计合成和组织样品基因组 DNA 的提取

从GenBank下载斑鳖属序列中幼发拉底斑鳖线粒体细胞色素b（cytb）基因序列31条，斑鳖cytb序列7条，其他斑鳖属序列10条进行多重序列比对后，利用Oligo6.71针对两种斑鳖cytb基因设计1对通用引物和2条特异性TaqMan探针（引物探针名称、序列及检测靶基因见表1）。引物和探针均由生物工程（上海）股份有限公司合成。

用无菌剪刀称取组织样品0.2 g，于0.01 mol/L pH 7.2 PBS缓冲液中充分匀浆后，制成10%混悬液，取200 μL悬液按照DNA提取试剂盒说明书提取纯化样品中总DNA。将纯化后的DNA 2 μL置于微核酸浓度仪上，以灭菌水为参考，测定浓度。

1.2.2 质控品制备

用组织样品DNA提取试剂盒提取幼发拉底斑鳖的 DNA，以其为模板，使用引物 C-F 和C-R扩增的目的片段克隆于PEsz-T载体，经测序比对证实目的基因与幼发拉底斑鳖相应细胞色素DNA同源性100%，命名为PEsz-T-Re-Cytb240，用作幼发拉底斑鳖核酸质控品制备。同时基因合成斑鳖240 bp （Genbank号：KJ482680.1）相应细胞色素基因的DNA片段克隆于pBSK载体，用作斑鳖核酸质控品制备。将上述两种质粒测浓度并换算成拷贝数（copies/μL）后，作10倍梯度稀释，用于方法建立与评价。

1.2.3 双重PCR体系的建立与优化

用10⁴～10⁶ copies/μL阳性质控品作为模板，对反应体系中的引物探针浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等条件进行优化，确定最佳反应体系和反应条件。

1.2.4 双重荧光PCR检测极限确定和标准曲线的研究

用优化后的条件对浓度分别为1～10⁶ copies/μL系列稀释的质粒DNA进行双重荧光PCR检测，将检测获得的Ct 值和不同拷贝数DNA的对数值做线性回归，计算相关系数R²。每个梯度设2个重复，每次均设置阴性对照以排除气溶胶污染。在对不同拷贝数DNA的检测中，确定方法的检测灵敏度。

1.2.5 特异性试验

使用已建立的方法对幼发拉底斑鳖核酸和斑鳖核酸、白唇泥龟、大麝香龟、巴西红耳龟、窄桥麝香龟、东北鳖、豹纹陆龟，以及猪、鸡、牛、马、羊等组织样品进行检测，以验证方法的特异性。

1.2.6 重复性试验

利用建立的方法分别对10³～10⁵ copies/μL拷贝数的DNA模板进行3次检测，计算各组变异系数，验证方法的可重复性。

1.2.7 临床验证

对58份送检龟鳖类样品进行检测，并与文献报道的普通PCR及产物测序方法进行比较。

2 结果

2.1 双重PCR体系的建立与优化

经优化确定反应体系，见表2。

表2 荧光 PCR 扩增反应体系

Table 2 Fluorescence PCR amplification reaction system

扩增条件：94℃ 4 min；94℃ 15 s，55℃ 15 s， 60℃ 1 min，40个循环；每个循环60℃延伸时分别收集FAM和ROX通道荧光信号。

结果判定：

质控对照：含幼发拉底斑鳖的基因质粒DNA阳性对照和含斑鳖的基因质粒DNA阳性对照分别应用两个检测通道读取数据时，应出现两条相应的特征性扩增曲线，且Ct值均应≤35.0。阴性对照无Ct值并且无特征性扩增曲线。

待测样本结果判定：

(1)若待测样品在FAM检测通道出现S形扩增曲线且Ct值＜35，ROX检测通道无特征性扩增曲线，则待测样本为幼发拉底斑鳖阳性或含有幼发拉底斑鳖成分。

(2)若待测样品在ROX检测通道出现S形扩增曲线且Ct值＜35，FAM检测通道无特征性扩增曲线，则待测样本为斑鳖阳性或含有斑鳖成分。

(3)若待测样品在FAM和ROX两个检测通道均无典型的扩增曲线时，则待测样本为幼发拉底斑鳖和斑鳖阴性。

(4)若待测样品在任一检测通道出现S形扩增曲线但35＜Ct值＜40时，须重新提取样本DNA进行复检，如仍出现典型S形扩增曲线，则说明待测样本中含有幼发拉底斑鳖或斑鳖成分。

2.2 灵敏度的测试结果

经对10倍稀释的含幼发拉底斑鳖和斑鳖目的基因质粒DNA进行检测，结果显示建立的双重荧光PCR反应体系检测灵敏度均可达10 copies/μL，见图1和图2，表明该方法的灵敏度可以满足应用要求。

2.3 双重荧光PCR标准曲线的建立

采用优化的方法对1～10⁶ copies/μL两种质粒进行荧光PCR检测，对基因浓度和Ct 值，用SDS2.3作线性回归，结果如图3（幼发拉底斑鳖）和图4（斑鳖）。结果表明，DNA浓度的对数与Ct 值呈线性相关。斜率分别为-3.132和-3.127， 相关系数R² 分别为0.9925和0.9947。

2.4 特异性试验结果

用建立的双重荧光PCR检测方法对白唇泥龟核酸、大麝香龟核酸、巴西红耳龟核酸、窄桥麝香龟核酸、东北鳖核酸、豹纹陆龟核酸，以及猪、鸡、牛、马、羊核酸检测结果均为阴性，但对斑鳖以及幼发拉底斑鳖核酸检测结果为阳性。结果表明，见图5、图6，所建立方法与上述非斑鳖物种不存在交叉反应，且斑鳖属间也无交叉反应。

2.5 重复性试验结果

使用优化的方法分别对浓度为10³ L～10⁵ copies/μL的DNA模板进行连续3次荧光PCR检测方法的重复性试验，计算各组Ct值的变异系数（CV%），从而验证方法的重复性和稳定性。结果表明，各组变异系数均小于5%，见表3。

表3 重复性试验结果

Table 3 Repeatability of test results

2.6 对实际样本的检测结果

应用建立的双重荧光PCR方法对58份送检龟鳖类样品进行检测，并与文献报道的普通PCR及产物测序方法进行比较。检出幼发拉底斑鳖阳性1份，见图7，该样品经通用引物扩增出现特异性目的条带，见图8，经测序和序列比对证实为幼发拉底斑鳖，见图9。其余样品检测结果均为阴性，与普通PCR扩增检测结果一致。

3 结论与讨论

3.1 讨论

斑鳖和幼发拉底斑鳖均为龟鳖目濒危物种^[4]，斑鳖分布于我国，目前数量极为稀少。幼发拉底斑鳖曾经广泛地分布于幼发拉底河流域，由于其栖息地丧失导致幼发拉底斑鳖数目急剧下降，近几十年来，由于其可食用性，又被大量捕杀和走私，导致其成为濒危物种。

目前，斑鳖的鉴别主要通过形态学方法进行^[5]，对于活体斑鳖，其形态特征比较显著，有经验的专业人员可以根据其特征快速而准确作出判定。但不法走私分子为逃避监管和处罚，常常将其制成特征不明显的产品，通过夹带方式进行走私，给海关执法带来困难。

为解决该类产品的准确快速鉴别问题，提供执法便利，研究建立了一种双重实时荧光 PCR 检测方法，可以同时鉴别幼发拉底斑鳖和斑鳖，可对反应条件进行了优化，该方法鉴定可在2小时内完成，并验证了该方法的特异性和灵敏性。 结果显示其灵敏度可达10 copies/μL，且与其他物种DNA不存在交叉反应。应用该方法对58份实验室留存送检样品进行了检测，检出幼发拉底斑鳖阳性1份，阳性样品经采用Cytb通用引物测序和序列比对的结果一致。该方法对幼发拉底斑鳖和斑鳖的鉴定具有良好的检测效果。该方法的建立为加强龟鳖类物种及其产品市场监管、打击龟鳖类非法贸易行为、加强龟鳖的保护， 提供了有力的技术手段。

3.2 结论

本研究在多重序列比对基础上，设计了1对通用引物和2条分别针对幼发拉底斑鳖和斑鳖的双标记短探针，通过使用系列稀释的标准质粒作为阳性质控品对反应体系进行优化，建立了灵敏、特异的双重荧光PCR检测方法，检测灵敏度可达10 copies/μL。使用建立的方法对实验室留存的送检龟鳖样品进行筛查，检出幼发拉底斑鳖阳性1份，对该份样品进一步扩增测序分析，表明其为幼发拉底斑鳖，证实了所建立方法的有效性和实用性。

表1 引物、探针的名称、序列及检测靶基因

Table 1 Name, sequence and target gene of primers and probes

△Rn

图1 幼发拉底斑鳖荧光PCR检测灵敏度结果

Fig.1 Sensitivity results of fluorescence PCR detection for R.euphraticus

图2 斑鳖荧光PCR检测灵敏度结果

Fig.2 Sensitivity results of fluorescence PCR detection in R. swinhoei

图3 幼发拉底斑鳖荧光PCR线性回归结果

Fig.3 Linear regression results of fluorescence PCR of R.euphraticus

图4 斑鳖荧光PCR线性回归结果

Fig.4 Linear regression results of fluorescence PCR of R. swinhoei

图5 幼发拉底斑鳖探针单通道荧光PCR检测结果图

Fig.5 Results of single-channel PCR of R. euphraticus probe

△Rn

图6 斑鳖探针单通道荧光PCR检测结果图

Fig.6 Results of single-channel PCR of R. swinhoei probe

△Rn

图7 58份样品中检出幼发拉底斑鳖阳性1份（FAM通道）

Fig.7 1 positive sample with R. euphraticus found in 58 samples (FAM channel)

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

M：DNA Marker 2000；1. 阴性对照negative control；2. 白唇泥龟肌肉组织Kinosternon scorpioides albogulare musculature；3. 大麝香龟肌肉组织Staurotypus triporcatus musculature；4. 巴西红耳龟肌肉组织Trachemys scripta elegans musculature；5. 红面泥龟肌肉组织Claudius angustatus isolate musculature；6. 幼发拉底斑鳖肌肉组织R.euphraticus musculature；7. 东北鳖肌肉组织Pelodiscus maackii musculature；8. 豹纹陆龟肌肉组织Stigmochelys pardalis musculature；9. 鸡肉chicken；10. 猪肉pork；11. 鸭肉duck meat；12. 牛肉beef；13. 羊肉mutton；14. 阳性对照positive control

图8 检出阳性样品电泳图谱

Fig.8 Electrophoretic spectrum of positive samples detected

图9 序列比对图谱

Fig.9 Sequence alignment map

参考文献

[1] 陈晶, 陈大庆, 严霞晖,等. 斑鳖资源现状研究进展[J]. 现代农业科技, 2017, 697(11): 224-226.

[2] 王剑, 史海涛, 韩联宪. Rafetus swinhoei名称的历史考证与中文名更改为"黄斑巨鳖"的建议[J]. 生物学通报, 2010, 45(7): 11-12.

[3] 王剑,史海涛.黄斑巨鳖分布的历史变迁[J]. Zoological Systematics, 2011, 36(4): 919-924.

[4] 赵肯堂. 濒临绝灭的斑鳖[J]. 大自然, 2005(2): 22-23.

[5] 傅金钟.中国产龟鳖类分类研究概述[J]. 动物学杂志, 1993, 28(1): 58-61.

（文章类别：CPST-C）