梅明珠1 高小博2 翁文川1 曹永长3 刘志玲1 吴晓薇1 段燕喻1 陈 茹1*

关键词 液相芯片；反刍动物；禽；猪；鱼；动物源性成分

Development and Application of a High-throughput Liquid Bead Array for Simultaneous Identification of Four Animal-derived Ingredients

MEI Ming-Zhu¹ GAO Xiao-Bo² WENG Wen-Chuan¹ CAO Yong-Chang³

LIU Zhi-Ling¹ WU Xiao-Wei¹ DUAN Yan-Yu¹ CHEN Ru^1*

Abstract Four pairs of primers and probes against ruminant, avian, swine or fish mitochondrial DNA(mtDNA) were designed and a 4-plex liquid bead was established. The specificity, sensitivity and repeatability of this method were then investigated. The results indicated that the species of interest can be identified, differentiated and detected down to 0.01-0.05 ng of genomic DNA from specific species. The coefficients of variation (CV%) in different concentration were all less than 20%. Testing of 195 commercial samples showed a good coincidence with the method used in routine testing. The high-throughput liquid bead array established in this study, which had a high level of specificity, repeatability and sensitivity, can be employed to detect ruminant, avian, swine and fish in processed products efficiently and effectively.

Keywords liquid bead; ruminant; avian; swine; fish; animal species

基金项目：广州市科技计划（201707010487），广州海关科技项目（2018GDK04）

第一作者：梅明珠（1981—），女，汉族，江苏南京人，博士，兽医师，主要研究方向为进出境动物疫病检测，E-mail: meimz@126.com

通讯作者：陈茹（1968—），女，汉族，海南海口人，博士，研究员，主要研究方向为进出境动物检疫分子生物学技术研发应用，E-mail: chenr@iqtcnet.cn

1. 广州海关技术中心 广州 510623

2. 国家卫生健康委科学技术研究所 北京 100013

3. 中山大学生命科学院 广州 510006

1. Guangzhou Customs Technology Center, Guangzhou  510623

2. National Research Institute for Family Planning, Beijing  100013

3. School of Life Science of Sun Yat-Sen University, Guangzhou  510006

动物源性成分检测鉴定是饲料与食品安全的重要内容，对维护人类和动物健康、保障进出口贸易安全与相关产业健康发展具有重要意义。精准检测鉴定饲料中动物源性成分，能够有效防范因动物疫病流行国家或地区的动物及其产品的非法输入导致的动物疫病传播风险，已有资料表明，用被痒病病原因子污染的反刍动物肉骨粉饲喂牛可引起牛海绵状脑病 ^[1-2] 。食品中动物源性成分的真伪鉴别鉴定，不仅能够保护消费者权利和健康，而且能够维护市场公平交易，一些不良商家以低价鸡肉、鸭肉和猪肉等冒充牛羊肉以获取利益的情况还时有发生 ^[3-4] 。因此，开展对饲料和食品等加工产品中动物源性成分检测鉴别技术研究具有重要意义。

目前，针对动物源性成分的检测主要依赖形态学、代谢物、蛋白质和核酸四类检测方法^[5]，每一种方法都有各自的特点及优势。其中，聚合酶链式反应（PCR）方法最为快速、准确，而荧光探针PCR检测的准确性和便捷性在所有检测方法中最突出^[6]。由于受到可获得荧光基团种类的限制，荧光探针PCR方法在同时检测多种动物源性成分时存在一定困难^[7]。液相芯片技术作为一种新型的生物技术，能够突破荧光PCR技术在多重检测方面的限制，同时保留了引物与目的基因、目的基因与探针的双重杂交，在多重检测分析时，确保了方法的特异性和准确性^[8-9]。目前，液相芯片技术已用于病原微生物、毒素和过敏物质的检测^[10-11]，在动物源性成分的检测中也有所报道^[12-14]。

本研究根据我国对鱼粉、肉骨粉、乳清粉等蛋白原料依赖进口的实际情况^[15]，并结合我国对进出口饲料的检疫监督要求，建立了同时检测反刍动物、禽、猪及鱼成分的四重液相芯片方法，并应用到饲料和食品样品的检测中，弥补了现行PCR检测方法在多重动物源性成分检测中的不足。

1 材料与方法

1.1 供试材料

46种用于特异性分析的单一物种的组织样品来自国内市场或屠宰场，其中，禽类有8种：白鸡、乌鸡、火鸡、鸭、鹅、鸽、鹧鸪和鹌鹑；反刍类动物有7种：黄牛、牦牛、水牛、绵羊、山羊、骆驼和鹿；鱼类有14种：太平洋鳕鱼、大西洋鳕鱼、三文鱼、鲭鱼、剥皮鱼、凤尾鱼、鲫鱼、鲮鱼、草鱼、鳙鱼、锦鲤、鲶鱼、巴沙鱼和白鲳鱼；其他物种：猪、狗、狐狸、驴、马、兔、蛇、水貂、龙虾、水晶虾、琵琶虾、草虾、珍宝蟹、黑蟹、面包蟹、青蟹、贝类混样（扇贝、蛤和象拔蚌）。标准牛肉粉GBW(E)100197（牛标准品）来源国家计量研究所（中国北京）；标准鸡肉粉GBW10018(GSB-9)（鸡标准品）来源地球物理和地球化学勘探研究所（中国廊坊）；标准猪肉粉GBW08552（猪标准品）来源中国科学院上海核研究所（中国上海）。1份全植物蛋白粉(含大豆，小麦和豌豆蛋白)，购自中国（广州）安利品牌。

127份饲料及饲料原料来源于进出口口岸，包括复合宠物食品、鱼粉、鸡肉骨粉（CMBM）、反刍动物肉骨粉（MBM）和猪血浆蛋白粉等。68份市售加工食品购于国内市场。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

对饲料样本采用天根动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒(货号：DP323-03)进行DNA提取，对食品样本采用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（货号：DP304-03）进行DNA提取。提取后用Nano Drop ND1000微量核酸测定仪测定上述DNA浓度，置于-20℃保存备用。

1.2.2 四重不对称扩增反应

根据本课题组前期筛选出的种属特异性的引物和探针^[12-14]，选取反刍动物、禽、鱼的广谱通用引物和猪的特异性引物进行四重不对称扩增反应。反应体系为：0.2 mmol/L的dNTPs、4 mmol/L的MgCl₂、20 mmol/L的Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L的KCl、0.5 mg/mL的牛血清白蛋白和3%的甘油、0.2 μL的热启动酶（5 U/μL）、1 μL的基因组DNA和引物混合物，然后用无核酸酶的超纯水补至25 μL。引物和探针信息详见表1。配好后置于PCR仪（Applied Biosystems，Foster city，CA，USA）进行扩增。反应条件为：95℃ 2 min，然后95℃ 5 s、54℃ 8 s、72℃ 2 s，35个循环，最后72℃延伸1 min，结束后4℃保存。

1.2.3 探针偶联及产物与微球-探针结合物的杂交

参照Luminex xMAP 操作手册进行探针偶联及PCR产物与微球-探针结合物的杂交。即选取4种不同荧光编码的羧化微球原液各20 μL分别与1 μL(100 μmol/L) 5'端标记C12氨基的反刍动物、禽、猪和鱼的特异性探针进行偶联，制成微球-探针结合物，然后将微球-探针结合物与四重PCR产物进行杂交。杂交体系为50 μL：33 μL 1.5× TMAC杂交液、 4 μL微球混合液（每种微球500个/1 μL）、5 μL PCR扩增产物、8 μL 1×TE（pH 8.0）。配好混匀后置于PCR仪中，设置杂交程序：95℃ 5 min，54℃ 20 min。杂交后立即加入100 μL预冷的 1× TMAC杂交液洗涤，两遍后，沉淀重悬于75 μL 含有3.3 μg/mL SAPE的1× TMAC报告液中，于54℃孵育10 min，最后用液相芯片仪200进行信号采集，每种编码微球收集50～100个，读取荧光信号（MFI）值。

1.2.4 四重液相芯片方法特异性的测定

利用本研究建立的四重液相芯片方法对上文1.1所列的46种物种样本、标准品以及植物蛋白粉的DNA进行检测。

1.2.5 四重液相芯片方法检测低限的测定

用10 mmol/L Tris-HCl将牛标准品、鸡标准品、猪标准品和红鱼粉的DNA进行10倍倍比的浓度梯度稀释，制备浓度范围1～0.001 ng/μL的DNA样本，然后用本研究所建立的四重液相芯片方法进行检测，以确定该方法的检测低限。每个样本各进行5次平行检测。检测低限（LOD）定义为5个重复都显示为阳性结果时的样本量。

1.2.6 四重液相芯片方法重复性的测定

选取中等浓度（1 ng/μL）、低浓度（0.1 ng/μL），以及检测限浓度的牛标准品、鸡标准品、猪标准品和红鱼粉DNA进行重复性测定，每份DNA样本均进行5次独立的重复检测，然后计算平均MFI值及其MFI值相对标准偏差值（CV%）。

1.2.7 饲料和食品样本的检测

应用本研究建立的四重液相芯片方法，对127份饲料样品以及68份食品样品进行检测，同时采用现行国家标准或行业标准方法进行牛、猪、鸡和鱼成分检测。

1.2.8 对照设置及判定阈值设定

每次检测同步设3个空白对照：以超纯水代替样本DNA进行PCR扩增，然后将该产物与探针-微球结合物进行杂交，测得MFI值，取平均值作为试验结果判定的本底值。结合参考文献和本课题组对已知样本和空白对照样本的大量检测试验，设判定标准如下：以本底值的5倍值为判定阈值，当被检样本的MFI值大于或等于判定阈值则判为阳性。对于MFI值小于判定阈值但数值接近的被检样本进行重复检测，按以上判定标准进行最终判定。

2 结果

2.1 四重液相芯片方法的特异性

利用本研究建立的四重液相芯片方法对实验室收集的单一物种样本DNA进行检测。结果表明：牛标准品、黄牛、水牛、牦牛、鹿、山羊、绵羊和骆驼样本只有反刍动物探针-微球结合物显示出阳性荧光信号，其余3种探针-微球结合物的MFI值均与本底相当，见图1(a)；鸡标准品、白鸡、乌鸡、火鸡、鸭、鹅、鸽、鹧鸪和鹌鹑样本只有禽探针-微球结合物显示出阳性荧光信号，其余3种探针-微球结合物的MFI值均与本底相当，见图1(a)；猪标准品和猪样本只有猪探针-微球结合物显示出阳性荧光信号，其余3种探针-微球结合物的MFI值均与本底相当，见图1(a)；太平洋鳕鱼、大西洋鳕鱼、三文鱼、鲭鱼、剥皮鱼、凤尾鱼、鲫鱼、鲮鱼、草鱼、鳙鱼、锦鲤、鲶鱼、巴沙鱼和白鲳鱼样本只有鱼探针-微球结合物显示出阳性荧光信号，其余3种探针-微球结合物的MFI值均与本底相当，见图1(b)。说明本研究所设计的物种特异性探针只与对应的目标物种PCR扩增产物结合，与其他3种物种PCR扩增产物不结合。此外，本研究对17种非目标物种进行检测，结果显示非目标物种的这4种探针的MFI值均与本底相当，见图1，表明本研究建立的四重液相芯片方法能精准检出鉴别4种目标物种，并与非目标物种均无交叉反应。

2.2 四重液相芯片方法的敏感性

采用四重液相芯片方法，按1.2.5所述，对10倍倍比稀释的牛标准品、鸡标准品、猪标准品和红鱼粉DNA进行检测。结果显示：该方法对牛标准品、猪标准品和红鱼粉DNA的检测低限可达0.01 ng/μL，对鸡标准品DNA的检测低限可达0.05 ng/μL。

2.3 四重液相芯片方法的重复性

对中等浓度（1 ng/μL）、低浓度（0.1 ng/μL）和检测限浓度（0.05 ng/μL或0.01 ng/μL）样本的5次独立试验结果进行分析，显示该方法在中、低浓度样本DNA检测时，目标物种对应的特异性探针的MFI值的CV%都小于10%；在检测限浓度时，目标物种对应的特异性探针的MFI值的CV%仍小于20%，见表2。

表2 四重xMAP检测方法的重复性

Table 2 Repeatablity of the 4-plex xMAP

2.4 饲料和食品样本检测结果

利用本研究建立的四重液相芯片方法对饲料和食品样本进行检测，结果显示：127份饲料样本中有15份样本检出未标注成分，主要为复合宠物食品（11份），检出的未标注成分主要为反刍动物（7份）、禽（6份）和猪（6份）成分；68份食品样本中有21份检出未标注成分，主要为肉丸（10份）和熟食肉（5份），检出的未标注成分主要为猪（18份）成分；68份食品样本中有1份市售鱼翅羹食品样本未检出标注的鱼成分。表3列出了检出成分与标签标注成分不一致的样本名称及检测结果信息。

表3 饲料与食品样品检测结果

Table 3 Results of the 4-plex xMAP assay performed on commercial samples

采用现行的国家或行业标准对收集的食品和饲料样本进行牛、猪、鸡和鱼成分的检测，其中，牛成分依据国家标准GB/T 20190-2006，猪成分依据国家标准GB/T 21101-2007，鸡成分依据行业标准SN/T 2978-2011，鱼成分依据行业标准SN/T 2867-2011。结果显示：四重液相芯片方法检出成分与标签标注成分一致的样本，利用国家或行业标准仍能检出对应成分；四重液相芯片方法检出成分与标签标注成分不一致的37份样本，利用四重液相芯片方法检出阳性的动物源性成分利用国家或行业标准检测仍为阳性，利用四重液相芯片方法未检出鱼成分的鱼翅羹食品样本利用行业标准检测仍为阴性，两种检测方法的结果完全一致。

3 讨论

PCR方法于2013年被欧盟官方认定为除显微镜检测技术以外的可用于仲裁检测的标准方法，也是我国推荐的检测方法^[16]。本研究建立的四重液相芯片方法经验证与现行标准推荐的PCR方法检测结果具有高度的一致性，说明本研究建立的四重液相芯片方法的检测准确性高。

目前，反刍动物、禽类、鱼类和猪成分的多重检测方法已有报道，Wu等^[13]建立的多重液相芯片方法能够同时检出5种反刍动物以及鸡和鸭的特异性成分。Dalmasso等^[17]也建立了饲料中反刍动物、禽类、鱼类和猪成分的四重PCR方法，能够检出3种反刍动物、2种禽类和12种鱼类成分。此外，一种商业化的液相芯片阵列检测试剂盒（Meat 5.0，Chipron GmbH，Berlin，Germany）能够同时检测17种肉类和7种禽类成分，但需要17对引物和探针。

本研究在本课题组前期建立的反刍动物、禽类和鱼类的三重液相芯片方法^[12]的基础上，增加了猪成分靶标，建立了四重液相芯片方法，利用4对引物和探针就能够检出7种反刍动物、8种禽类、14种鱼类和猪成分，检测种类更广泛，检测成本更低，能够更好地满足进出口安全把关需求，并且更全面有效地阻截饲料等动物产品中牛海绵状脑病、高致病性禽流感、非洲猪瘟等重大动物疫病传播风险因子。同时，利用我们建立的四重液相芯片方法对深度加工处理的肉制品和高温处理的肉骨粉进行检测，检出结果良好。目前，食品的掺假欺诈行为多发生在肉眼难辨的深度加工食品，该方法的建立能够为打击食品中掺假欺诈行为提供有力的技术支撑。在本研究中，我们发现有1份鱼翅羹食品样本中鱼成分的两种检测方法的结果均为阴性，这可能是因为该食品中不含鱼翅成分或含量极低，已低于正常的检测水平。

4 结论

综上所述，本研究建立的四重液相芯片方法特异性好、敏感性高，能够同时检测反刍动物、禽、鱼和猪成分，检测图谱广、检测成本低、检测时间短，可实现高通量检测，为保障进出口饲料和食品的安全提供了强有力的技术支撑，特别是在动物新发疫病初期，在疫病病原未确定时，对疫区易感动物源性成分的监控显得尤为重要。

表1 种属特异性引物和探针

Table 1 Primers and probes used in the 4-plex xMAP assay

(a) 陆生动物检测结果

(a) Results of terrestrial

(b) 水生动物和植物蛋白粉检测结果

(b) Results of aquatic animal and plant power

图1 四重液相芯片的特异性

Fig.1 Specificity of the 4-plex xMAP

表3（续）

参考文献

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（文章类别：CPST-B）