滕新栋1 刘 迪1

Establishment of a Dual Detection Method for Zika Virus and Chikungunya Virus

TENG Xin-Dong¹ LIU Di¹

Abstract This study established a dual PCR method for the detection of Zika virus (ZIKV) and Chikungunya virus (CHIKV), so as to increase the detection methods of ZIKV and CHIKV nucleic acid. ZIKV and CHIKV NS3 genes were selected as targets, and two groups of characteristic primers were designed, and synthetic NS3 plasmids were used to verify the primers. At the same time, ZIKV and CHIKV cDNA were used to evaluate the specificity and sensitivity of the method. The NS3 gene fragments of 164 bp and 230 bp were obtained by using ZIKV and CHIKV cDNA as templates, respectively. No amplification bands was found in the corresponding control viruses, suggesting that there was no cross reaction between NS3 amplification sequences of ZIKV or CHIKV and the corresponding control viruses, and the detection limit of both viruses was 120 pg/μL. The dual detection method of ZIKV and CHIKV nucleic acid established in this study lack ssensitivity, but has good specificity, which can be used as a detection method to meet the needs of ZIKV and CHIKV nucleic acid detection at ports.

Keywords ZIKV; CHIKV; duplex PCR

基金项目：青岛海关科技计划项目（QK201905，QK202008）

第一作者：滕新栋（1987—），男，汉族，山东青岛人，博士，副主任技师，主要从事病媒生物监测和传染病监测，E-mail: tengxindeng@163.com

1.青岛海关 青岛 266071

1. Qingdao Customs, Qingdao 266071

近年来，全球新发和再发传染病疫情频发，寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus, CHIKV）作为蚊媒病毒再次出现，引起全世界关注。2种病毒主要通过白蚊伊蚊和埃及伊蚊叮咬传播，寨卡病毒还可通过性接触、母婴传染、输血和血液制品以及器官移植等途径进行传播^[1]。

寨卡病毒是蚊媒传播的黄病毒科、黄病毒属病毒，20%～25%感染寨卡病毒的患者会患上一种登革热样综合征，症状广泛，如结膜炎、头痛、发烧、关节痛、斑丘疹和四肢肿胀等，有时会引起格林巴利综合征、小头畸形和胎儿中枢神经系统其他畸形^[2-3]。基孔肯雅病毒属于披膜病毒科、甲病毒属病毒，高达90%感染此病毒的患者出现以头痛、高热、斑丘疹、肌痛、关节痛和可能持续数年的严重乏力为特征的临床症状^[4-5]。

采取合适方法诊断和合理措施治疗传染病患者，对控制传染病的发生与传播意义重大。基孔肯雅病毒和寨卡病毒的传播媒介具有共通之处，2种病毒感染人群初期发病时临床症状相似度很高，疾病流行区域有很多交叉的地方，给临床合理诊断和治疗增加了诸多困难^[2]。本研究初步建立了寨卡病毒和基孔肯雅病毒的双重PCR检测方法，为防控蚊媒传染病提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

PrimeScript^TMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒、TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒、dNTPs和Taq DNA聚合酶等购自宝日医生物技术（北京）有限公司；DL2000 Marker购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 核酸来源

寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革病毒（Dengue virus, DENV）核酸由军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所馈赠；黄热病毒（Yellow fever virus, YFV）核酸由本单位保存的黄热减毒活疫苗（北京生物制品研究所有限责任公司）提取所得；乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）核酸由本单位保存的乙型脑炎灭活疫苗（辽宁成大生物股份有限公司）提取所得。

1.3 引物设计合成、质粒合成和病毒核酸逆转录成cDNA

根据NCBI数据库中20个寨卡病毒基因组^[6]和20个基孔肯雅病毒基因组（MT150100.1、MT150099.1、MT150098.1、MT150097.1、MT150092.1、LC500221.1、LC500219.1、LC500218.1、LC500216.1、MH329298.1、MH329297.1、MK134713.1、MK134712.1、MG967666.1、MG921596.1、MF773564.1、MF773563.1、MF773562.1、LC259092.1、LC259089.1）的NS3基因序列，分别以NC_035889.1和MT150100.1为模板，利用Primer Premier 5.0和DNAMAN软件设计寨卡病毒和基孔肯雅病毒NS3基因序列片段的特异性扩增引物：ZIKV-NS3-2-F：5′-GCTCCCAAGGAAGTAA-3′，ZIKV-NS3-2-R：5′-CCTTCACCGCTTCTCAGC-3′；CHIKV-NS3-7-F：5′-GTAGGACCAAACTTCTCAAA-3′，CHIKV-NS3-7-R：5′-TCTCGGCAGTAGATGACCACG-3′。合成寨卡病毒和基孔肯雅病毒 NS3基因序列，并分别构建到pUC57载体质粒上。引物和质粒由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

利用PrimeScript^TMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，将寨卡病毒、基孔肯雅病毒、登革病毒、黄热病毒和乙型脑炎病毒核酸逆转录成cDNA。

1.4 寨卡病毒和基孔肯雅病毒 NS3合成质粒验证引物

PCR扩增体系：0.5 μL EX-Taq酶，1 μL质粒模板，1 μL引物F，1 μL引物R，1 μL dNTP混合液，3 μL 10×EX-Taq buffer，22.5 μL ddH₂O，共30 μL。

PCR反应条件：变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火52℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，共30个循环；延伸72℃ 5 min。经2%琼脂糖凝胶电泳验证后，PCR产物交由生物公司测序并进行序列分析。

1.5 特异性试验

扩增寨卡病毒cDNA，设置基孔肯雅病毒、登革病毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒核酸和ddH₂O对照；扩增基孔肯雅病毒cDNA，设置寨卡病毒、登革病毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒核酸和ddH₂O对照。寨卡病毒cDNA PCR扩增体系：0.5 μL EX-Taq酶，1.5 μL cDNA模板，1 μL引物F（CHIKV 0.5 μL），1 μL引物R（CHIKV 0.5 μL ），1 μL dNTP混合液，3 μL 10×EX-Taq buffer，22 μL ddH₂O（CHIKV 23 μL），共30 μL。PCR反应条件同步骤1.4，经2%琼脂糖凝胶电泳验证后，PCR产物交由生物公司测序并进行序列分析。

1.6 灵敏性试验

利用微量紫外分光光度计（Merinton SMA4000）测定寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸浓度，用无菌水进行10倍倍比稀释，逆转录成cDNA后，按照1∶1的比例添加寨卡病毒和基孔肯雅病毒cDNA模板，进行双重PCR。PCR扩增体系：0.5 μL EX-Taq酶，1.5 μL ZIKV cDNA，1.5 μL CHIKV cDNA，1 μL ZIKV-NS3-2-F，1 μL ZIKV-NS3-2-R，0.5 μL CHIKV-NS3-7-F，0.5 μL CHIKV-NS3-7-R，1 μL dNTP混合液，3 μL 10×EX-Taq buffer，19.5 μL ddH₂O，共30 μL。PCR反应条件同步骤1.4。利用2%琼脂糖凝胶检测扩增产物，确定灵敏度。

2 结果

2.1 NS3合成质粒验证引物结果

以寨卡病毒和基孔肯雅病毒NS3基因合成的质粒为模板，扩增获得164 bp和230 bp的NS3基因片段，如图1所示。经基因测序和序列比对分析发现，NS3基因片段不同于相应对照病毒的基因序列，特异性较好。

2.2 特异性试验结果

分别以寨卡病毒和基孔肯雅病毒cDNA为模板，扩增获得164 bp和230 bp的NS3基因片段，如图2和图3所示，而相应对照病毒均未发现164 bp或230 bp的扩增条带，提示寨卡病毒或基孔肯雅病毒NS3扩增序列与相应对照病毒无交叉反应。经基因测序和序列比对分析发现，寨卡病毒NS3基因片段不同于基孔肯雅病毒、登革病毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒的基因序列，特异性较好；基孔肯雅病毒NS3基因片段不同于寨卡病毒、登革病毒、黄热病毒、乙型脑炎病毒的基因序列，特异性较好。

2.3 灵敏度试验结果

利用微量紫外分光光度计（Merinton SMA4000）测定寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸浓度后，将寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸浓度均处理成12 ng/μL，用无菌水进行10倍梯度稀释，核酸浓度分别为12 ng/μL、1.2 ng/μL、120 pg/μL、12 pg/μL，逆转录成cDNA后，按照1∶1的比例添加寨卡病毒和基孔肯雅病毒cDNA模板进行双重扩增。结果显示，至稀释度12 pg/μL时没有扩增条带，寨卡病毒和基孔肯雅病毒的检测限均为120 pg/μL，如图4所示。

3 讨论

寨卡病毒、基孔肯雅病毒的传播途径具有共通之处，疾病流行区域的交叉之处也很多，病毒感染后的临床症状早期相似度很高，并且可能存在交叉感染，对病毒早期诊断有重要影响^[7-8]。本研究通过对寨卡病毒和基孔肯雅病毒基因组进行生物信息学分析，选取2种病毒的NS3基因作为靶基因，利用NS3基因合成质粒和病毒核酸初步建立了2种病毒的双重PCR检测方法。

利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，发现其灵敏度为120 pg/μL（转换成拷贝数的数量级约为10⁷ 拷贝/μL），灵敏度低于实时荧光定量PCR法^[7]。琼脂糖凝胶电泳本身检测产物的灵敏度低，无法准确判断检测方法的实际灵敏度，实际应用时需要与实时荧光逆转录PCR、恒温扩增等技术相结合。利用部分黄病毒属核酸作为对照病毒，以及寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸相互作为对照，显示扩增引物特异性较好。

寨卡病毒和基孔肯雅病毒多重检测已有多项报道研究，主要检测靶标为NSP1、NSP2、NSP4、E、3'UTR等基因。基于E、NSP1或NSP4基因的三重实时荧光逆转录PCR检测方法，寨卡病毒和基孔肯雅病毒在不同RNA提取方式下的检测限接近10³个基因组拷贝当量/mL，同时检测每位患者的一种以上标本类型可增加6.4%的诊断敏感性，高灵敏度在确定寨卡病毒病例方面有较好的实用性^[7,9-10]。结合通用RT-PCR扩增和鉴定杂交到特定探针的三重检测方法，使用培养和量化的全病毒库检测CHIKV的限值为1 TCID₅₀/mL，寨卡病毒限值为10 TCID₅₀/mL，特异性100%，寨卡病毒和基孔肯雅病毒的诊断敏感性分别为87.88%和94.34% ^[11]。基于NSP1、E基因等的四重实时荧光逆转录PCR检测方法，可对常规样品中的寨卡病毒和基孔肯雅病毒进行特异性、灵敏性的鉴别，每种病毒有2个靶点的组合可以100%覆盖大约500个基因组^[12]。基于 3'UTR、NSP2等的五重实时荧光逆转录PCR检测方法，寨卡病毒在血清或尿液中的检测限为100个RNA拷贝/反应，基孔肯雅病毒在血清中的检测限为10个RNA拷贝/反应^[13]。

4 结语

传统PCR方法不能同时检测多种病原体，但多重PCR可同时检测多种病原体，并且已经广泛应用于基因分型与定量、基因突变与缺失、伴药诊断、遗传检测等领域，大幅提升检测效率的同时，还可以降低检测成本^[14]。本研究建立的寨卡病毒和基孔肯雅病毒双重检测方法特异性较好，可节约实验成本，减少样本用量，简化实验步骤，为寨卡病毒和基孔肯雅病毒的检测鉴别和蚊媒传染病疫情防控提供技术支撑。

图1 寨卡病毒和基孔肯雅病毒NS3合成质粒扩增图谱

Fig.1 Amplification chart of NS3 synthetic plasmids of Zika virus and Chikungunya virus

图2 寨卡病毒cDNA扩增特异性试验图谱

Fig.2 Specific experimental amplification chart of Zika virus cDNA

图3 基孔肯雅病毒cDNA扩增特异性试验图谱

Fig.3 Specific experimental amplification chart of Chikungunya virus cDNA

寨卡病毒和基孔肯雅病毒核酸浓度：1为12 ng/μL；2为1.2 ng/μL；3为120 pg/μL；4为12 pg/μL

The nucleic acid concentrations of Zika virus and Chikungunya virus: 1, 12 ng/μL; 2, 1.2 ng/μL; 3, 120 pg/μL; 4, 12 pg/μL

图4 寨卡病毒和基孔肯雅病毒双重PCR灵敏度试验

Fig.4 Dual PCR sensitivity test of Zika virus and Chikungunya virus

参考文献

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（文章类别：CPST-B）

第3卷 第9期

2021年9月