杨永超1 杜 宇1 张媛媛1 何 成1 于艳军1 韩 伟1 李宁涛1 王利兵1*

Determination of Bisphenol A and Bisphenol S in Thermal Papers by High Performance Liquid Chromatography

YANG Yong-Chao¹ DU Yu¹ ZHANG Yuan-Yuan¹ HE Cheng¹

YU Yan-Jun¹ HAN Wei¹ LI Ning-Tao¹ WANG Li-Bing^1*

Abstract A sensitive and rapid method was developed for the determination of bisphenol A and bisphenol S (BPA and BPS) in thermal papers by high performance liquid chromatography (HPLC). The progress was performed on Agilent 1200 with Acclaim™ 120-C18 reversed-phase column (150 mm×4.6 mm, 5 μm) under the isocratic elution of methanol and water (V/V＝55/45), subsequently detected by diode array detector (DAD) at 280 nm (BPA) and 260 nm (BPS) in this method. The flow rate was set at 0.8 mL/min. The results displayed that BPA and BPS had good linearity within the concentration range of 1-100 mg/L. The corresponding linear correlation coefficients were all equal to 0.9999. And the limits of detection and quantification (LOD and LOQ) were 5 μg/g, 2.5 μg/g and 25 μg/g, 10 μg/g respectively. Recovery experiments were then carried out at 3 levels with low, medium and high concentrations. The average recoveries were between 85.6%～104.1% and relative standard deviations (RSD) were all below 5%. The experiments proved that the simple and accurate method with low LOD could serve for food packaging papers supervision in determination of the BPA and BPS.

Keywords thermal papers; bisphenol A and bisphenol S; high performance liquid chromatography (HPLC)

基金项目：国家重点研发计划课题（2019YFC0810902）；天津海关科研项目（2020THK011）

第一作者：杨永超（1985—），男，汉族，天津人，博士，高级工程师，从事消费品安全检测工作，E-mail: ycyang119@163.com

通讯作者：王利兵（1967—），男，汉族，博士，研究员，主要从事食品安全工作，E-mail: LibWang@163.com

1.天津海关工业产品安全技术中心 天津 300308

1. Technical Center for Safety of Industrial Products, Tianjin Customs, Tianjin  300308

双酚A（bisphenol A，BPA）结构与天然激素相似，可模仿天然激素，破坏激素系统。长期接触大量双酚A会影响生殖和激素系统功能，或导致心血管疾病和发育异常^[1-3]。根据最近研究观察，暴露于双酚A可改变非糖尿病成人胰岛素反应，甚至可能导致II型糖尿病^[4]。

尽管如此，BPA还被广泛应用于碳酸酯、树脂、涂料和食品包装生产过程中。同时也用于热敏纸，如购物小票、打印纸、传真纸、出租车机打车票等。双酚S（bisphenol S，BPS）作为BPA的等价物质，同样会严重威胁人体健康，扰乱生殖系统，影响胚胎发育^[5]。皮肤经常接触热敏纸，其中的BPA和BPS会溶于皮肤上的汗液，进而经表皮或经口进入人体内，造成健康危害。欧盟第10/2011号法规^[6]中，BPA对食品的特定迁移限制为0.6 mg/kg，BPS为0.05 mg/kg。GB 5749-2006《生活饮用水卫生标准》^[7]规定饮用水BPA不得大于0.01 mg/L；我国国家标准GB 4806.6-2016《食品安全国家标准 食品接触用塑料树脂》^[8]规定了BPS特定迁移限量为0.05 mg/kg，BPA特定迁移限量为0.6 mg/kg。GB/T 34455-2017^[9]《纸、纸板和纸浆 2,2-二(4-羟基苯基)丙烷(双酚A)的测定 液相色谱法》仅给出了纸类商品中BPA的检测方法，但是未涉及BPS。因此，建立同时快速检测热敏纸中BPA和BPS方法具有重要意义。

目前，BPA和BPS的检测方法主要有分光光度法^[10]、薄层色谱法^[11]、气质联用法^[12]、液相色谱^[13-14]和液质联用法^[15]等。但是，薄层色谱法准确度和灵敏度不高；分光光度法需要严格控制酸碱度，同时易受基质物质中有色基团的影响；气质和液质联用法涉及质谱，成本较高；液相色谱法相对比较实用，但是已有报道均只涉及双酚A或双酚S单种物质的检测。本实验建立了同时测定热敏纸中BPA和BPS的高效液相色谱法，该方法简单、快速，为BPA和BPS的检测提供了一种可行的技术方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪，配置二极管阵列检测器（DAD），美国安捷伦公司； S 30H型超声波清洗机，德国Elma公司；紫外可见分光光度计Uv-2450，日本岛津公司。

双酚A标准物质（BPA），CAS：80-05-7，纯度≥99.0%，双酚S标准物质（BPS），CAS：80-09-1，纯度≥99.0%，均购自德国Dr.Ehrensorfer公司；色谱纯甲醇购自德国merk公司。热敏纸来源于当地超市小票，快餐外卖小票，出租车小票。

1.2 方法

1.2.1 HPLC条件

色谱柱: Acclaim™ 120-C18（150 mm × 4.6 mm, 5 μm）；流速为0.8 mL/min；柱温：室温；检测波长：BPA-280 nm和BPS-260 nm；进样体积5.0 μL。流动相：甲醇/水（V/V＝55/45）等度洗脱。

1.2.2 标准储备液配制

准确称取BPA和BPS各10 mg（精确至0.1 mg）分别置于10 mL容量瓶中，以甲醇定容，配成质量浓度为1.0 mg/mL的标准溶液；分别准确移取BPA和BPS标准溶液1.0 mL至10 mL容量瓶中，定容，得浓度为100 mg/L的BPA和BPS混合标准储备液。

1.2.3 样品处理

将热敏纸样品裁剪成5 mm×5 mm的小片，混合均匀。精确称取0.1000 g样品置于25 mL的锥形瓶中，加入10 mL甲醇，在40℃水浴中超声提取40 min后取出，氮吹浓缩至5 mL以下，待溶液冷却至室温后定容至5 mL，经0.45 μm滤膜过滤，滤液备用。

2 实验结果

2.1 检测波长的确定

在190～700 nm范围内，测定各标准溶液BPA和BPS紫外-可见吸收光谱，见图1。结果表明，BPA的两个吸收峰波长为228 nm和280 nm，BPS的两个吸收峰波长分别为236 nm和260 nm。为了避免200 nm左右溶剂和杂质峰的干扰，方法选择BPA的检测波长为280 nm，BPS为260 nm。

2.2 色谱柱的选择

试验考察了Acclaim™ 120-C18，InertSustain C18分离效果，见图2，柱子尺寸均为150 mm × 4.6 mm, 5 μm。结果表明，Acclaim™ 120-C18和InertSustain C18柱都可以很好地分离BPA和BPS，但是使用InertSustain C18时，BPA和BPS的峰会呈现前沿现象，因此，选择Acclaim™ 120-C18柱。

2.3 流动相和流速的选择

试验考察了乙腈/水、甲醇/水作流动相对BPA和BPS分离效果的影响。结果发现，使用乙腈/水时，BPS的峰出现拖尾现象；当使用甲醇/水时，BPA、BPS完全分离，峰形尖锐，对称性好，因此，选择甲醇/水作为流动相。

图2 色谱柱对分离的影响

Fig.2 The impact of columns on separation

另外，两种物质在甲醇/水等度洗脱过程中，可实现完全分离，不需要梯度洗脱。等度洗脱过程中，最终确定流动相比例为甲醇/水（V/V）＝55/45，该条件下，BPA和BPS分离度好，整体洗脱时间可控制在6 min之内。

试验选定了甲醇/水（V/V）＝55/45为流动相，在此基础上，考察了0.5 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min流动相流速对试验的影响，见图3。试验证实，流速为0.5 mL/min时，洗脱时间延长，峰形展宽；流速为0.8 mL/min和1.0 mL/min时，BPA和BPS均能很好分离。为节省流动相，减少污染，试验最终选定流速为0.8 mL/min。

图3 流动相流速对分离的影响：（a）1.0 mL/min；（b）0.8 mL/min；（c）0.5 mL/min

Fig.3 The impact of flow rate on separation: (a) 1.0 mL/min; (b) 0.8 mL/min; (c) 0.5 mL/min

2.4 提取剂的选择

试验考察了甲醇、乙腈、丙酮、正己烷和水的提取效率，见图4。结果显示，对于BPA和BPS的提取，甲醇和丙酮的提取效率最高，大于98%，但是丙酮更易挥发，同时是易制毒试剂，其他溶剂的效率较低，因此，方法最终选择甲醇为提取剂。

图4 不同溶剂对于BPA和BPS的提取效率的影响

Fig.4 The efficiencies of different solvents for BPA and BPS

2.5 提取温度和时间的确定

以甲醇为提取剂，研究最佳的提取温度。甲醇的沸点为64.7℃，故试验对比了不同温度25℃、30℃、40℃、50℃、60℃下的提取效果。结果表明，随着温度的增加，BPA和BPS的提取效率增加，40℃时达到最高，50℃和60℃与40℃时基本持平，从节省能源和减少甲醇挥发方面考虑，方法选择的提取温度为40℃。

以甲醇作为萃取剂，萃取温度为40℃，又考察了提取时间（10～60 min）对提取效果的影响，提取时间为40 min时，提取几近完全，40～60 min变化不明显，因此，方法最终选择提取时间为40 min。

2.6 线性范围和检测限（LOD）、定量限（LOQ）

以1.2.2混合储备液为基础，用甲醇稀释，得到BPA和BPS浓度为1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L 、100 mg/L的系列混合标准溶液。上机测试，记录BPA和BPS的峰面积，每个浓度点测试3次，取平均值。以浓度（mg/L）为横坐标x，峰面积为纵坐标y，进行线性回归。得到的回归曲线如表1所示，结果显示，在1～100 mg/L范围内，BPA和BPS线性良好，相关系数均为0.9999。

逐级稀释标准溶液方法，信噪比（S/N）为3时的样品浓度即为检测限浓度（the limit of detection，LOD）；S/N为10时的样品的浓度即为定量限浓度（the limit of quantification，LOQ）。如表1所示，本方法BPA、BPS仪器的LOD和LOQ分别为0.10 mg/L、0.05 mg/L和0.50 mg/L、0.20 mg/L，以0.1 g称重量和5 mL定容体积计算，方法的LOD和LOQ分别为5 μg/g，2.5 μg/g和25 μg/g和10 μg/g。

表1 BPS和BPS在浓度范围1～100 mg/L的线性回归方程、相关系数和检出限、定量限

Table 1 Regression equations, correlation coefficients, the limits of detection and quantification (LOD and LOQ) of BPA and BPS in the concentration range of 1-100 mg/L

2.7 回收率和精密度（RSD）试验

阳性样品制备：将阴性热敏纸样品剪成5 mm×5 mm的碎片，称取0.1000 g于25 mL的锥形瓶中，根据需要，加入定量的混合标准储备液，加适量甲醇，混合，润湿全部样品，最后自然挥发至干，得阳性样品。

按上述方式制备低、中、高三浓度水平阳性样品，测试添加回收率，每个浓度点平行6次。从表2可见，三水平添加回收率在85.6%～104.1%之间，相应的RSD在0.95%～4.75%之间，参考标准GB/T 27404《实验室质量控制规范 食品理化检测》^[16]对方法进行评价，方法的加标回收试验结果以及准确度和精密度均表现良好，见表2。

2.8 样品检测

从当地市场上搜集20个热敏纸样品，包括超市小票，快餐外卖小票和出租车票据。按该方法对样品进行分析，测试结果显示，5个样品检出BPA，最高含量可达36.6 mg/kg，1个样品检出BPS，见图5。通过实际样品的检测，可知热敏纸市场确实存在着一定风险，应加强监管。

图5 样品（a）与标准溶液（b）的色谱图对比

Fig.5 The comparison of spectra of sample (a) and standard solution (b)

3 结论

本研究建立了热敏纸中BPA和BPS含量测定的高效液相色谱法。方法中BPA和BPS的最低检出限可达5 μg/g和2.5 μg/g，加标回收率在 85.6%～104.1%，相对标准偏差小于5%。该方法具有前处理简单、稳定性好、回收率高等优点，检测结果准确可靠，可用于同时测定热敏纸中BPA和BPS的含量。同时，实际样品检测出BPA和BPS，证明市场存在一定风险。

Wavelength (nm)

Wavelength (nm)

图1 （a）BPA和（b）BPS的紫外吸收图谱

Fig.1 The UV-VIS spectra of (a) BPA and (b) BPS

表2 BPA和BPS低、中、高3浓度水平添加回收试验（n＝6）

Table 2 Recovery results of BPA and BPS at 3 levels with low, medium and high concentrations (n＝6)

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（文章类别：CPST-C）

第3卷 第9期

2021年9月

Applied Research / 应用研究