林君峰1,2 徐添贵2 沈雅蕾1,2 王成云1 白 爽2 冯均利1,2 谢堂堂2*

Simultaneous Determination of 7 Isothiazolinone Antibacterial Agents in Textiles by Gas Chromatography/Tandem Mass Spectrometry

LIN Jun-Feng^1,2 XU Tian-Gui² SHEN Ya-Lei^1,2 WANG Cheng-Yun¹

BAI Shuang² FENG Jun-Li^1,2 XIE Tang-Tang^2*

Abstract A gas chromatography/tandem mass spectrometry (GC/MS-MS) analytical method that can determine 7 isothiazolinone antibacterial agents in textiles was developed. This method used methanol as the extraction solvent to extract textiles under optimized ultrasonic conditions. The extract was processed and analyzed by GC/MS-MS, and the external standard method was used for quantification. By adding standard addition to the blank sample, it was found that at 3 different addition concentration levels, satisfactory results were obtained (the average recovery rate of addition was 80.45%-95.84%, and the RSD was 2.72%-12.58%). At 10 times the signal-to noise ratio (S/N＝10), the lower limit of quantification (LOQ) for MI, CMI, BIT and DCOL were all 0.10 mg/kg, and the LOQ for MBIT, OI and BBIT were all 0.05 mg/kg. The proposed method was fast, simple, efficient, effective and durable, and its LOQ is low, which can well meet the needs of daily monitoring.

Keywords gas chromatography/tandem mass spectrometry (GC/MS-MS); textiles; ultrasonic extraction; isothiazolinone; antibacterial agents

基金项目：新疆维吾尔自治区重大专项（2020A03002-1），国家标准制订项目（20183022-T-608）

第一作者：林君峰(1982—)，男，高级工程师，从事进出口商品检验及鉴定工作，E-mail: wangchengyun2009@126.com

通讯作者：谢堂堂(1982—)，男，博士，研究员，从事进出口商品检验及鉴定工作，E-mail: tangtangxie@139.com

1. 深圳市检验检疫科学研究院 深圳 518010

2. 深圳海关工业品检测技术中心 深圳 518067

1. Shenzhen Academy of Inspection and Quarantine, Shenzhen 518010

2. Shenzhen Customs Industrial Product Detection Technology Center, Shenzhen 518067

含有五元杂环的有机化合物在许多工业部门都发挥着重要作用。其中含有异噻唑结构以及其衍生物的化合物因其具有抗微生物、抗真菌、抗病毒等性能，在不同的领域得到了广泛应用^[1]。在纺织品中，其优异的抗菌性，被广泛应用于需要抗菌的产品中^[2-3]。人们在研究其抗菌性能的同时，也在不断关注着其毒害性能^[4-9]。研究发现，部分异噻唑啉酮类抗菌剂会导致睾丸生殖细胞死亡，损害人体和鱼类的生殖系统；部分异噻唑啉酮类抗菌剂具有神经毒性和致敏性，可引发接触性皮炎；职业性接触异噻唑啉酮类抗菌剂甚至能导致中毒性肝病死亡。研究结果引起了各国的高度重视，并不断出台新的限量法规限制其使用^[10-12]。随着法规的出台，现在被限制使用的异噻唑啉酮类抗菌剂共有7种，见图1。异噻唑啉酮可采用紫外-可见分光光度法、气相色谱法、气质联用法、高效液相色谱法、液质联用法等方法测定^[13-19]，涵盖7种异噻唑啉酮类抗菌剂的测试方法在文献中暂未见到，为此，本文建立了一个能同时测定纺织品中7种异噻唑啉酮类抗菌剂的气相色谱串联质谱分析方法。

图1 7种异噻唑啉酮类化合物

Fig.1 Seven isothiazolinone compounds

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

GCMS-TQ 8040MX（日本岛津公司）气相色谱-三重四级杆质谱；自动裁样机（中山启元）；超声波水浴控温仪(美国Bransonic公司)；全自动旋转蒸发仪（日本Eyela公司）；全自动氮吹仪（青岛海科仪器有限公司）。

甲醇购买于美国赛默飞世尔科技有限公司（HPLC级）；标准品CMI、MBIT、BBIT购买于德国Dr. Ehrenstorfer GmbH公司（纯度均大于95%），OI、MI、BIT购买于西格玛奥德里奇公司（纯度均大于99%），DCOI购买于日本TCI会社（纯度大于95%）。准确称取合适重量，用甲醇将其配置成浓度为1000 g/mL的含有各组分的单标。移取适当的体积，将上述组分的单标配备为混标。再将上述混标进行一定的比例稀释后，可以得到一系列浓度的混合标准工作曲线。

1.2 样品前处理

选取具有代表性的样品，用裁样机裁剪成5 mm×5 mm的小块，充分混合均匀以后，称取1.0 g样品放置于萃取器中，在萃取器中加入20 mL的甲醇。然后将萃取器放置于超声水浴中，超声时间为20 min，超声萃取温度为45℃。将萃取液过滤后用容量为200 mL的鸡心瓶收集。残渣按照上述方法再萃取一次。将两次萃取液合并到鸡心瓶中，并用全自动旋转蒸发仪将溶剂蒸发至近干，然后再用氮吹仪吹干。鸡心瓶中的残留物用1 mL甲醇溶解，过0.45 μm滤膜后，收集到进样小瓶中，待GC/MS-MS分析。必要时，先进行适当稀释。

1.3 分析条件

1.3.1 色谱条件

RXi-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气及流速：氦气（纯度＞ 99.999%），流速1.1 mL/min。采用程序升温模式，初始温度90℃，以15℃/min升温至280℃并保持3 min。进样口温度为270℃。进样方式：不分流进样，进样体积为1 μL。

1.3.2 质谱条件

扫描方式：多反应检测（MRM）；电离方式：EI，电离能：70 eV；传输线温度为280℃。四级杆温度和离子源温度分别为150℃、210℃。溶剂延迟3 min，优化后的离子对条件见表1。

2 结果与讨论

2.1 超声萃取条件的优化

为获得最优的萃取条件，对萃取溶剂的种类及用量、萃取时间、萃取温度等影响超声萃取效率的关键因素进行了优化。在以甲醇作为萃取溶剂的条件下，对找到的6个市面上售卖的阳性样品进行萃取，其中1#样品为梭织真丝连衣裙，2#样品为针织真丝女式长袖套头衫，3#样品为纯棉女式短袖衬衫，4#样品为平纹机织染色女式棉上衣，5#样品为梳织亚麻女式长袖衬衫，6#样品为梳织亚麻男式衬衫，6个样品中均检出OI。设计三因素三水平的正交设计实验。在进行正交设计实验之前，先对每个因素的最优值进行确定。通过循环固定其中的两个实验条件，然后变动剩下的条件，可以得出当萃取时间为20 min、萃取溶剂体积为20 mL、萃取温度为40℃时，萃取量均达到各自条件的最大值。将单因素优化出来的最优萃取条件套入到表格2中的正交试验设计表中。在表2所示的条件下得出6个样品的各自萃取量以及总萃取量。通过极差分析表2的数据可知，6个阳性样品的最优试验方案是各不相同的，分析结果见表3。其中1#、5#样品的优方案均为A₂B₃C₃，2#、3#、4#样品和总萃取量的优方案均为A₂B₂C₃，6#样品的优方案为A₃B₂C₃。依据综合条件评分法，得出最后的最优方案为A₂B₂C₃。在此优方案下，考察连续多次萃取时样品中目标物的残留量情况，结果发现在第3次萃取时，6个样品均未检出目标物，经连续萃取2次，可以将目标物全部萃取出来。根据上述的萃取条件，优选萃取溶剂，以及表4中所列12种萃取溶剂，对6个阳性样品进行目标物萃取。结果表明，甲醇具有最优的萃取效率。综上可知，以20 mL甲醇为萃取溶剂，萃取温度为45℃，超声时间为20 min，连续超声萃取2次，可作为超声萃取目标物的最优条件。

2.2 分析条件的优化

气相色谱-串联质谱在检测过程中，为了定性和定量的准备，需要对目标物的离子对（母离子和子离子）、碰撞电压、停驻时间进行参数优化，以使其达到最优的检测结果。上述的色谱条件下，先进行全面扫描分析，确定目标物的保留时间和母离子，再利用产物离子扫描方式来优化碰撞电压下获得的二级碎片离子，最后采用多反应检测模式（MRM），采用分段扫描的模式进行分析，设置3个时间段，可以有效保证每个组分都具有良好的峰型，并达到较高的灵敏度，最终得到的MRM总离子流图，见图2，7种异噻唑啉酮类抗菌剂的多反应检测模式条件，见表1。从图2中可见，7种异噻唑啉酮类抗菌剂谱峰完全分离，峰型尖锐，对称性好。

1: MI; 2: CMI; 3: BIT; 4: MBIT; 5: OI; 6: BBIT; 7: DCOI

图2 混合标准溶液的GC/MS-MS总离子流图

Fig.2 Total ion flow diagram of mixed standard solution in GC/MS-MS

2.3 线性关系和定量下限

将配置好的标准工作曲线，在选定的仪器分析条件下进行分析，用峰面积对化合物浓度依据最小二乘法进行线性拟合，结果如表5所示，从表5可知，7种异噻唑啉酮类抗菌剂化合物的线性关系良好，相关系数均大于0.999。根据大于3倍信噪比和10倍信噪比各自确定方法的检出限（LOD）和定量下限（LOQ），结果见表5所示。

2.4 回收率和精密度

选择标准棉贴衬、涤纶贴衬、桑蚕丝贴衬和亚麻贴衬作为空白阴性样品，样品添加不同浓度的混合标准溶液，按照上述方法进行萃取和浓缩，用气相色谱串联质谱仪进行测定所得的平均回收率为80.45%～ 95.84%，相对标准偏差（RSDs, n＝9）为2.75%～12.58%。

2.5 实际样品测试

应用本方法测定256个市售纺织品，结果在6个样品中均检测出不同含量的OI（6个样品均用于2.1中超声萃取条件优化实验），检出量分别为6497 mg/kg、732 mg/kg、807 mg/kg、9956 mg/kg、335 mg/kg、8786 mg/kg，远高于欧盟限量要求（10 mg/kg）。这6个样品均是在织物印染后整理过程中使用抗菌剂进行整理，采用浸渍、浸轧、涂层、喷雾等方法将抗菌剂施加到纤维上。图3是其中一个阳性样品的总离子流图，可以看到在保留时间为9.040 min处出现1个尖锐谱峰，该保留时间与OI标准溶液的保留时间(t_R＝ 9.040 min)一致。

图3 某阳性样品的GC/MS-MS图

Fig.3 GC/MS-MS diagram of a positive sample

3 结论

建立一种可以测定纺织品中7种异噻唑啉酮类抗菌剂的气相色谱-串联质谱（GC/MS-MS）分析方法。该方法利用甲醇作为萃取溶剂，在优化后的超声条件下对纺织品进行萃取，萃取液经处理后用GC/MS-MS进行分析，使用外标法进行定量。通过对空白样品进行加标测定，发现在3个不同的加标浓度水平下，具有良好的结果（平均加标回收率为80.45%～95.84%，RSD为2.72%～12.58%）。在10倍信噪比（S/N＝10）下，MI、CMI、BIT、DCOI的定量下限均为0.10 mg/kg，MBIT、OI、BBIT的定量下限均为0.05 mg/kg。该方法具有快速、简单、高效、耐用等特点，而且其定量下限低，可以很好满足日常检测需求。

表1 MRM条件

Table 1 MRM conditions

表2 超声萃取正交实验

Table 2 Orthogonal experiment of ultrasonic extraction

表3 超声萃取正交实验数据分析

Table 3 Data analysis of ultrasonic extraction orthogonal experiment

表4 不同溶剂的萃取效果

Table 4  The extraction effect of different solvents

表5 线性关系和定量下限

Table 5 Linearity and LOQ

强度 (mAu)

2

0

4 6 8 10

t (min)

参考文献

[1] 王磊, 武绍峰, 顾学斌. 异噻唑啉酮类杀菌剂的应用研究[J]. 工业微生物, 2015, 45(5): 60-64.

[2] 刘玉勇, 孔令红, 朱泉,等. 异噻唑啉酮类抗菌整理剂的制备及应用[J]. 印染助剂, 2009, 26(10): 15-18.

[3] 魏玉娟. 毛织物防霉整理工艺及性能研究[J]. 毛纺科技, 2015, 43(5): 26-29.

[4] Mose A P, Frost S, Ohlund U, et al. Allergic contact dermatitis from octylisothiazolinone[J]. Contact Dermatitis, 2013, 69(1): 49-52.

[5] Dahlin J, Isaksson M. Occupational contact dermatitis caused by N-butyl-1,2- benzisothiazolin-3-one in a cutting fluid[J]. Contact Dermatitis, 2015, 73(1): 60-62.

[6] Zirwas J M, Hamann M D, Warshaw I E, et al. Epidemic of isothiazolinone allergy in North America: prevalence data from the North American Contact Dermatitis Group 2013- 2014[J]. Dermatitis, 2017, 28(3): 204-209.

[7] 吕鹏, 徐嘉擎, 王森,等. 杀菌剂苯并异噻唑啉酮对斑马鱼胚胎的急性毒性和氧化应激效应研究[J]. 生物技术通报, 2018, 34(2): 172-182.

[8] Li M H. Comparative toxicities of 10 widely used biocides in three freshwater invertebrate species[J]. Chemistry and Ecology, 2019, 35: 472-482.

[9] 任兴华，沈瑞鹏，李延柠，等. 职业性接触异噻唑啉酮致中毒性肝病死亡1例[J]. 法医学杂志, 2019, 35(6): 769-771.

[10] EN 71-9-2005: Safety of toys Part 9: Organic chemical compounds -Requirement[S].

[11] Regulation (EU) No. 528/2012 of the European Parliament and of the Council of 22 May 2012 concerning the making available on the market and use of biocidal products[J]. Official Journal of the European Union, 2012, L167: 1-123.

[12] Biocidal Products Committee (BPC) Opinion on the applications for approval of the active substance: MBIT Product type: 6 (ECHA/BPC/154/2017) [S].

[13]张建枚, 潘亚男,白桦. UV法测定异噻唑啉酮衍生物活性物含量[J]. 工业水处理, 2011, 31(5): 70-71.

[14]陆军,矫筱蔓,佟晓波,等. 气相色谱法同时测定化妆品中15种防腐剂[J]. 日用化学工业, 2012, 42(2): 146-149.

[15] Alvarez-Rivera G, Dagnac T, Lores M, et al. Determination of isothiazolinone preservatives in cosmetics and household products by matrix solid-phase dispersion followed by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2012, 1270: 41-50.

[16]黄萍, 杜中, 方光伟, 等. 气相色谱-质谱联用法测定纺织品中2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮等5种防腐剂[J]. 分析试验室, 2015, 34(3): 279-283.

[17]谢堂堂, 王成云, 林君峰, 等. 超高效液相色谱法快速测定纺织品中5种异噻唑啉酮类抗菌剂[J]. 分析仪器, 2016, (3): 32-37.

[18]王成云, 张伟亚, 林君峰. UPLC/ Orbitrap HRMS法测定纺织品中异噻唑啉酮[J]. 印染, 2016, (21): 43-47.

[19]谢堂堂,王成云,林君峰,等. 纺织品中抗菌剂和紫外线吸收剂的同时测定[J]. 分析仪器, 2017, (4): 21-31.

[20]王成云, 褚乃清,李泳涛,等. 皮革及其制品中7种限用异噻唑啉酮类抗菌剂的气相色谱/串联质谱法测定[J]. 西部皮革, 2021, (7): 22-26.

[21]王成云,冯均利,白爽,等. 气质联用法同时测定皮革及其制品中7种限用异噻唑啉酮类抗菌剂[J]. 皮革与化工, 2021, 38(2): 10-15.

[22]王成云,张伟亚,林君峰,等. UPLC/Orbitrap HRMS法测定纺织品中异噻唑啉酮[J]. 印染, 2016, 42: 43-47.

（文章类别：CPST-C）

第3卷 第9期

2021年9月

应用研究 / Applied Research