贺生芳1 姜肖军1 纳秀萍1 郝俊虎1

Validation and Analysis of Staphylococcus aureus Proficiency Testing in Food Testing

HE Sheng-Fang¹ JIANG Xiao-Jun¹ NA Xiu-Ping¹ HAO Jun-Hu¹

Abstract To improve the detection ability of laboratory, Strengthen the ability to identify the special colonies, expand laboratory influence and enhance competitiveness. According to the proficiency testing instructions provided by the Chinese Academy of Inspection and Quarantine and the national standard Food Microbiology Inspection Staphylococcus aureus Inspection(GB 4789.10-2016), two samples of proficiency testing were qualitatively tested for Staphylococcus aureus. One samples was found to have no hemolysis on the blood agar plates. And the Quantitative Real-time PCR method was used as an auxiliary, and 20-P 282 strain was not detect Staphylococcus aureus, 20-Q 642 strain was detect Staphylococcus aureus. The results of this proficiency test are satisfy. In the detection of specifical colonies, the national standard method can be used together with the real-time PCR（the molecular biology detection method）to ensure the accuracy of experimental results and reduce the possibility of missed detection.

Keywords proficiency testing; Staphyloccocus aureus; Hemolysis; Quantitative Real-time PCR

第一作者：贺生芳（1989—），女，汉族，青海人，硕士，中级兽医师，主要从事动物疫病研究，E-mail: 819434478@qq.com

1.银川海关技术中心 银川 750001

1.Yinchuan Customs Integrated Technology Center, Yinchuan 750001

金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是一种人畜共患致病菌，能引起食物中毒、肺炎、心胞炎等症状，严重威胁人类健康^[1-2]。近年来，在食品中检出金黄色葡萄球菌被频繁报道，金黄色葡萄球菌的被关注度越来越高。金黄色葡萄球菌也是进出口动物食品必检微生物，因此实验室急需建立准确、快速、高效的金黄色葡萄球菌检测方法^[3-4]。在实验室检测工作中，在最短的时间内，在含极少目标菌的样本中检出金黄色葡萄球菌，或能有效辨别特殊形态的金黄色葡萄球菌，对防治动物疫病、保障食品安全具有重要意义。

能力验证是检验实验室人员能力、实验室质量控制的重要方式 。为提高金黄色葡萄球菌的检测能力，本实验室参加了由中国检验检疫科学研究院组织实施的食品中金黄色葡萄球菌定性检测能力验证，本次能力验证中实验室检测依据为GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》^[5-6] 。传统细菌分离培养法操作烦琐，需要4～5 d，对实验室人员的操作能力要求较高，需要很高的专业能力和丰富的检测经验。利用实时荧光定量PCR扩增法进行辅助鉴定，能够在分子水平上进行鉴定，即使样本中目标物质很少，也能高效检测到。因此，分子生物学检测方法辅助传统的微生物培养法，可有效提高检测效率，增强对特殊菌落的鉴别能力，丰富实验室人员对金黄色葡萄球菌的鉴别经验，提高实验室检测能力^[7-8]。

1 材料和检测方法

1.1 样品和标准菌株

2份能力验证样品分别为20-P 282和20-Q 642，采用西林瓶真空密封包装，由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供，金黄色葡萄球菌标准菌株CICC 10201和CICC 10306，表皮葡萄球菌CICC 10436均购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 培养基及试剂

氯化钠肉汤（7.5%）、Baird-Parker培养基、血平板、血浆凝固酶、营养琼脂（NA）均购于北京陆桥生物科技有限公司，金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测试剂盒购于北京陆桥生物科技有限公司，革兰氏染色液购于环凯生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备

高压蒸汽灭菌锅（致微仪器有限公司），生物安全柜（西班泰克净化设备有限公司），生化培养箱（CLIMACELL），生物显微镜（日本OLYMPUS公司），荧光定量PCR扩增仪（AB公司steponeplus）。

1.4 检测方法

1.4.1 样品处理

按照能力验证作业指导书，在生物安全柜内无菌打开真空冻干管20-P 282和20-Q 642，用营养肉汤充分溶解转移冻干管的内容物作为待测溶液为检测样品^[9]。检测流程按照GB 4789.10-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》进行，标准菌株按照样品同步开展。

1.4.2 增菌

样品20-P 282和20-Q 642，标准菌株CICC 10201和CICC 10306，各吸取1 mL加入到9 mL 7.5%氯化钠肉汤中，充分混匀后放置（36±1）℃培养箱中培养18～24 h，同时以10 mL 7.5%氯化钠肉汤为空白对照。

1.4.3 分离培养

前增菌过后的培养物，每个样品分别接种1环划线至Baird-Parker平板以及血平板上，接种后的Baird-Parker平板和血平板均放到（36±1）℃培养箱中培养18～24 h。

1.4.4 初步生化鉴定

（1）革兰氏染色、镜检

在Baird-Parker平板和血平板上分别选取形态可疑的菌落进行革兰氏染色、镜检。金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，呈葡萄球状排列，直径约为0.5～1 µm，无荚膜，无芽孢。

（2）血浆凝固酶实验

在Baird-Parker平板或血平板上分别挑选至少5个可疑菌落（小于5个全选），分别接种到5 mL脑心浸出液肉汤BHI和营养琼脂平板NA，均放置在（36±1）℃培养箱中培养18～24 h。

取新鲜兔血浆一支（0.5 mL），加入上述脑心浸出液肉汤BHI培养物0.3 mL，振荡，充分混匀，放置在（36±1）℃培养箱内，每0.5 h观察一次（此时避免剧烈振荡），不间断观察6 h。以金黄色葡萄球菌标准菌株CICC 10201为阳性对照，以表皮葡萄球菌CICC 10436为阴性对照。

1.4.5 可疑菌落荧光定量PCR扩增检测

依照金黄色葡萄球菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的说明进行可疑菌落PCR扩增。在挑取的5个可疑菌落所接种的营养琼脂平板上，分别用无菌枪头挑取1个单菌落加入到20 µL荧光定量PCR反应体系中，扩增条件为95℃，30 s；95℃，5 s，60℃，30 s，40个循环，观察扩增结果。

2 结果与分析

2.1 前增菌结果

样品20-Q 642、20-P 282和标准菌株CICC 10201、CICC 10306在7.5%氯化钠肉汤中培养后，培养液均呈现浑浊状态，而7.5%氯化钠肉汤对照液体清亮，无浑浊，无杂质（表1）。

表1 分离平板上的菌落特征

Table 1 Colony characteristics on the selective separation plate

2.2 分离培养

通过Baird-Parker平板上的菌落形态初步判断，20-Q 642号样品有很小的淡黄色、乳白色菌落生长，与对照标准菌株菌落形态不一致；20-P 282号样品菌落形态呈灰黑色、黑色，菌落有光泽，菌落直径在2～3 mm，菌落周围有肉眼可见明显的沉淀圈，与对照标准菌株菌落形态一致（图1）。20-Q 642号样品在血平板上为乳白色菌落，周围没有透明溶血圈，与对照标准菌株菌落形态不一致；20-P 282号样品在血平板上光滑凸起，湿润、菌落周围没有透明溶血圈，与对照标准菌株菌落形态不一致，标准菌株CICC 10201和CICC 10306在血平板中菌落周围有明显的肉眼可见的透明溶血圈（图2）。

左上：样品20-P 282 右上：样品20-Q 642

左下：.CICC 10201 右下：CICC 10306

图1 在Baird-Parker平板上生长状态

Fig.1 Grew status on the Baird-Parker plate

左上：样品20-P 282 右上：样品20-Q 642

左下：CICC 10201 右下：CICC 10306

图2 样品及标准菌株在血平板生长情况

Fig.2 Growth of sample and standard strain in blood plate

2.3 初步生化检定结果

对可疑菌落经过镜检和血浆凝固酶实验，20-P 282号样品镜检为革兰氏阳性菌落，排列呈葡萄球状，与阳性标准菌株CICC 10201镜染结果一致（图3）；20-Q 642号样品镜检为革兰氏阴性菌落，排除为金黄色葡萄球菌的可能。挑取20-P 282号样品中5个可疑菌落与阳性、阴性对照菌落同时进行血浆凝固酶实验，2 h内呈现凝固现象（表2）。

左：标准菌株CICC 10201 中：样品20-P 282 右：样品20-Q 642

图3 革兰氏染色图

Fig.3 Gram staining diagram

表2 初步生化检定结果

Table 2 Results of preliminary biochemical experiments

2.4 可疑菌落的实时荧光定量PCR法鉴定

对样品20-P 282在琼脂平板上的菌落进行PCR检测，5个琼脂平板上各挑取一个，结果5个菌落均有“S型”典型扩增曲线，和标准菌株扩增一致（图4），5个菌落的扩增Ct值均≤25（表3），说明为金黄色葡萄球菌阳性。

3 讨论

目前，金黄色葡萄球菌在实验室检测中普遍采用国家标准GB 4789.10-2016《食品微生物学检验 金黄色葡萄球菌检验》，国家标准检测法中对金黄色葡萄球菌在血平板的形态特征描述得很详细，在血平板上，菌落形态偏大，偏圆、凸起、湿润、单菌落周围有肉眼可见的完全透明的溶血圈^[10-11]。然而从这次能力验证的样品检测发现，在血平板上生长的菌落并没有可见透明溶血圈，因此仅根据金黄色葡萄球菌的生长特点和生化特性不能排除漏检的可能性，如果实验室人员经验不足，遇到本文中的情况，很容易疏忽漏筛，造成假阴性结果，导致检测结果错误，因此在传统培养法的基础上，采用实时荧光定量法进行辅助鉴定，实时荧光定量法耗时短，高效快速，操作简便，在增菌或分离培养后直接进行核酸提取和扩增检测，快捷方便^[12-13] ，依据扩增曲线和Ct值，实时观察反应结果，避免可疑菌落的挑选，避免漏筛的可能，所以结果更为准确可靠，大大增加了检出的可能性。

4 结论

本次能力验证，分离培养基选用Baird-Parker，结果发现20-Q 642号样品没有出现典型菌落，20-P 282号样品出现典型菌落，而接种血平板后发现，20-P 282号样品并没有出现典型的溶血现象，再结合分子生物学检测方法，检测核酸后，通过扩增曲线和Ct值能够确认20-P 282号样品为金黄色葡萄球菌，因此，建议在针对类似的能力验证情况之时，尤其是在发现有特殊形态或生化现象的菌落时，在传统培养法的基础上可以结合分子生物学方法^[13-14]，提高实验的效率和准确度。

图4 可疑菌落荧光定量PCR扩增图

Fig.4 Fluorescence quantitative PCR amplification of suspicious colonies

表3 可疑菌落荧光定量PCR扩增Ct值

Table 3 Ct value of fluorescence quantitative PCR amplification of suspicious colonies

△Rn

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（文章类别：CPST-A）