李 贺1,2 张承康3 温建荣4 林 玲2 李 敏1 曾思海2 陈劲松2

Development of Positive Plasmids for Identification of 10 Quarantine Pests

LI He^1,2 ZHANG Cheng-Kang³ WEN Jian-Rong⁴ LIN Ling²

LI Min¹ ZENG Si-Hai² CHEN Jin-Song²

Abstract This study constructed a positive plasmid that can be used for the identification of 10 quarantine pests. Through the analysis of plant epidemic data, 10 quarantine pests with high risk of invasion were screened out. The characteristic sequences of 10 quarantine pests were integrated into the same pUCm-T vector plasmid by DNA homologous recombination technology, and its specificity were verified. A recombinant plasmid containing the specific sequences of 10 quarantine pests was obtained, which has the obvious advantages of easy storage, low risk and specificity, and can be used as a positive control to screen 10 quarantine pests effectively.

Keywords quarantine pests; positive control; plasmid

基金项目：厦门海关科研项目（2020XK05）

第一作者：李贺（1988—），男，汉族，河南漯河人，硕士，农艺师，主要从事植物检疫，E-mail: 916113342@qq.com

1.福州海关技术中心 福州 350000

2.泉州海关综合技术服务中心 泉州 362000

3.宁德师范学院 宁德 352000

4.厦门海关技术中心 厦门 361000

1. Technology Center of Fuzhou Customs District, Fuzhou 350000

2. Technology Center of Quanzhou Customs District, Quanzhou 362000

3. Ningde Normal University, Ningde 352000

4. Technology Center of Xiamen Customs District, Xiamen 361000

通过分析海关植物疫情截获数据发现，2018年1月—2020年2月，全国口岸截获检疫性有害生物392种、140291批次，其中，截获检疫性细菌13种、369批次，分别占比3.32%、0.26%；截获检疫性真菌22种、1496批次，分别占比5.61%、1.07%。而在《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》（以下简称《名录》）中，检疫性真菌和细菌数量占比高达42%。口岸截获数据与《名录》中数据对比的悬殊，在一定程度上反映了检疫性真菌、细菌鉴定工作的难度。

阳性对照作为分子生物学鉴定工作的基础工具，能够有效排除干扰因素，减少后期工作量，使鉴定工作更有针对性。目前，相关研究主要集中在转基因成分筛查领域^[1-3]，在植物检疫领域还未见研究报道。

通常基层植物检疫实验室可能会存在以下问题：（1） 储备的阳性对照种类少，大多是历年截获留存菌株，活体菌株具有扩散风险，各地口岸实验室菌株样本交流存在限制；（2） 阳性对照保存形式单一，多以活体菌株或DNA溶液形式储存，活体菌株需要定期活化培养，存在扩散风险；DNA溶液虽然使用方便，但储存周期短，易降解，无法长期保存^[1-2] ；（3） 活体菌株和DNA溶液都只具备单一对照功能，在储存和鉴定工作中不具备经济性、实用性。

为提高检疫性有害生物的检出率，本研究根据海关植物疫情截获信息和口岸一线植物检疫截获现状，筛选出以下10种检疫性有害生物：豌豆细菌性疫病菌、十字花科黑斑病菌、苹果壳色单隔孢溃疡病菌、大豆疫霉病菌、南美大豆猝死综合症病菌、北美大豆猝死综合症病菌、大豆茎褐腐病菌、菜豆晕疫病菌、菜豆细菌性萎蔫病菌、马铃薯纺锤块茎类病毒。这10种检疫性有害生物中，有8种存在通过进境大豆传播风险，而十字花科黑斑病菌可能通过大豆中掺杂的油菜籽携带传播。本研究首先通过对这10种检疫性有害生物特征序列和特异性引物的分析，将其按照特定的组合分为4组，然后分别通过PCR扩增获得10种检疫性有害生物特征序列片段，利用衔接引物将其组合成4个大片段，最后利用无缝克隆试剂盒将其定向整合到同一载体质粒中。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究所用的10种检疫性有害生物DNA样品分别由上海海关、厦门海关、深圳海关、重庆海关提供，部分样品为本实验室前期截获、储备。

E.coli DH5a菌株、限制性内切酶（EcoRⅠ、KpnⅠ、HindⅢ、BamHⅠ）、即用型无缝克隆试剂盒、T载体PCR产物快速连接试剂盒、DNA合成和测序服务等均购自生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 实验仪器

梯度PCR仪（TC-5000，英国Techne公司）；电泳仪（HE33，美国Hoefer公司）；凝胶成像系统（JS780A，上海培清科技有限公司）；高速冷冻离心机（G-26C，德国Sartorius公司）；恒温摇床（ZQTY-70V，上海知楚仪器有限公司）；恒温恒湿培养箱（BXY-800S，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；超低温冰箱（REVCO-86ELite PLUS，美国Thermo Fisher公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 检疫鉴定方法的收集

根据海关植物疫情截获信息和本实验室菌种储存情况，筛选出10种检疫性有害生物，并查阅收集10种检疫性有害生物相关检疫鉴定国家标准、行业标准和公开文献中的分子生物学检疫鉴定方法，见表1。根据不同鉴定方法的权威性，优先选择国家标准、行业标准作为鉴定依据。对于无分子生物学鉴定标准的检疫性有害生物，优先选择检验检疫行业内专家公开文献中的鉴定方法，其中，苹果壳色单隔孢溃疡病菌菌株为2018年泉州海关截获，由泉州海关综合技术服务中心植物检疫实验室鉴定，并经上海海关技术中心复核确认。

1.3.2 质粒构建与验证

在NCBI数据库检索10种检疫性有害生物的特征序列，通过DNAMAN生物学软件分析，将10种特征序列按照特定顺序排列，以避免扩增时产生非特异性条带。通过Primer Premier 5.0软件设计衔接引物和分析酶切位点，使用无缝克隆试剂盒将10种携带衔接引物和酶切位点的特征序列导入pUCm-T载体，得到XMHG-T10质粒。使用10种检疫性有害生物检疫鉴定方法中的引物（表1），以XMHG-T10质粒为模板分别进行PCR检测，验证检疫鉴定方法中的引物是否仍具有特异性。将XMHG-T10质粒送生工生物（上海）股份有限公司测序，得到重组质粒真实序列。

2 结果与分析

2.1 生物学软件分析

10种检疫性有害生物的特征序列分别以拉丁学名缩写代替，豌豆细菌性疫病菌（Pspp）、十字花科黑斑病菌（Psm）、苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Bs）、大豆疫霉病菌（PsG）、南美大豆猝死综合症病菌（FT）、北美大豆猝死综合症病菌（FV）、大豆茎褐腐病菌（BSR-A）、菜豆晕疫病菌（PspG）、菜豆细菌性萎蔫病菌（Cff）、马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）。

由于衔接引物的存在，10对特异性引物的碱基个数均由原来的20个左右增至40个左右，引物扩增的模板也由10种检疫性有害生物各自的基因组序，列变为10种检疫性有害生物的特征序列和载体序列的组合体。因此，需要重新分析10对引物的特异性，通过对10种特征序列和载体序列不同排列组合的分析，尽可能排除非特异性产物。

以8种有害生物的特征序列组合1为例，组合顺序为：Pspp、PsG、BSR-A、FV、FT、PspG、Psm、Cff。

通过生物学软件DNAMAN分析，得到特征序列组合1中PsG-R引物的相似位点，结果如下：

Sequence 202009载体8片段组合2.seq for primer: cutoff＝80.0%

#1 score 122.0(100.0%), 0 gaps

586 GTGGCCTTCGGGCTGC

||||||||||||||||

1 GTGGCCTTCGGGCTGC

#2 score 102.0(83.6%), 4 gaps

611 GTGG....CGGGCTGC

|||| ||||||||

1 GTGGCCTTCGGGCTGC

Sequence 202009载体8片段组合2.seq minus strand for primer: cutoff＝80.0%

No site

分析发现，PsG-R引物在组合1的正链586 bp位置（R₁）和611 bp位置（R₂）存在相似序列，经判断R₁为PsG-R引物特异性结合位置，R₂为PsG-R引物非特异性结合位置，使用PsG-F/R引物扩增时，可能会产生354 bp的错误产物，从而干扰试验结果判定。因此，需要重新调整有害生物特征序列的组合顺序。

通过多次验证，最终确定10种有害生物特征序列的组合顺序为Pspp、Psm、Bs、PsG、FT、FV、BSR-A、PspG、Cff、PSTVd。

2.2 衔接引物的设计和重组质粒的获得

通过PCR扩增获得10种检疫性有害生物的特征序列片段，设计衔接引物，见表2，并分别引入EcoRⅠ、KpnⅠ、BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。将10个片段分别通过PCR扩增组合成4个大片段，以降低多片段无缝克隆的难度。

第1个大片段组合PPB（1342 bp）为Pspp、Psm、Bs，大小分别为272 bp、670 bp、400 bp。首先，将Pspp、Psm、Bs片段通过衔接引物扩增连接为1个PPB片段，然后通过双酶切连接到pUCm-T载体质粒中，再以Pspp-F和Bs-R为前后引物筛选阳性克隆，如图1所示。

M：DNA Marker（分别为100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp）；泳道1：PPB片段，1342 bp；泳道2、3、4、5、7未得到目的大小的片段；泳道6为阴性对照

图1 PPB片段的筛选

Fig.1 Screening of PPB fragment

第2个大片段组合PTV（1436 bp）为PsG、FT、FV，大小分别为329 bp、655 bp、452 bp。第3个大片段组合PCP（1166 bp）为PspG、Cff、PSTVd，大小分别为500 bp、306 bp、360 bp。PTV与PCP均采用与PPB相同的方法，通过衔接引物扩增分别将3个小片段连接为一个大片段。第4个大片段为BSR-A（1020 bp），因其本身较大，未与其他片段进行组合。

最后经双酶切处理，使用无缝克隆试剂盒将4个大片段整合到pUCm-T载体中。

2.3 阳性克隆的筛选

将重组质粒导入E.coli DH5a感受态细胞，经过筛选培养基在37℃过夜培养，挑选标号为1-2、2-3、3-1、4-4的转化子。提取质粒后，分别用M13F/PsGR和PspGF/M13R两对引物扩增（M13F和M13R为pUCm-T载体通用引物）。M13F/PsGR目标条带约1.8 kb，PspGF/M13R目标条带约1.2 kb。经验证，编号为1-2和2-3的转化子符合预期结果，如图2所示。

M：DNA Marker(分别为100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp)；泳道1～4是引物M13F/PsGR扩增编号，分别为1-2、2-3、3-1、4-4的转化子；泳道6～9是引物PspGF/M13R扩增编号，分别为1-2、2-3、3-1、4-4的转化子；泳道5和10是阴性对照

图2 阳性克隆的筛选

Fig.2  Screening of positive clones

2.4 重组质粒验证

对编号为1-2的阳性转化子提取质粒，以该重组质粒为模板，分别用10种检疫性有害生物的特异性引物（表1）进行PCR扩增，得到的片段大小均符合预期结果，如图3所示。

对该重组质粒进行DNA测序，测序范围从pUCm-T载体通用引物M13F端到M13R端，测序反应的引物为通用引物M13F/M13R和10种检疫性有害生物特异性引物的依次组合，每个反应之间均设置重叠区域，以保证测序结果的准确性。测序结果拼接后获得全长为5113 bp的序列信息，经DNAMAN生物学软件比对分析，该重组质粒测序结果与理论序列一致性达99.08%，符合预期结果。将该重组质粒命名为XMHG-T10，通过DNAMAN软件制作其对应的质粒图谱，如图4所示。

3 结论

据海关统计数据在线查询平台公开信息，2020年我国黄大豆进口量突破1亿t，进口量增加，外来有害生物防控压力也随之加大。我国是大豆的原产地，具有丰富的野生大豆种质资源^[9]，一旦外来有害生物入侵，不仅会危害国内的大豆产业，野生大豆种质资源也会遭受无法弥补的损失。因此，提高检疫性有害生物的鉴定能力已成为各口岸植物检疫实验室的迫切需求。本研究通过分析海关植物疫情截获数据和口岸一线植物检疫截获现状，重点针对进口大豆中可能携带的检疫性有害生物，开发出包含10种检疫性有害生物特征序列的XMHG-T10重组质粒。

通常情况下，无缝克隆试剂盒只用于不超过5个片段的重组连接，而且随着片段数量的增多，连接效率也会大大降低。因此，本研究通过设计不同的酶切位点和衔接引物，将10种检疫性有害生物的特征序列片段分别定向组合成4个大片段，以提高连接效率和准确度，再使用无缝克隆试剂盒将4个大片段整合到pUCm-T载体中。同时，由于重组序列来自10种不同的检疫性有害生物，需要考虑这10段特征序列所对应的10对引物在扩增时是否会产生非特异性条带，因此，提前通过生物学软件分析不同组合顺序下产生非特异性条带的可能性十分必要。

本研究获得的XMHG-T10重组质粒具有易储存、低风险、经济实用的显著优势，能够作为阳性对照定性筛查多种检疫性有害生物，提高植物检疫工作效率。另外，因PCR灵敏度高，而质粒DNA具有较高的稳定性，为避免实验室出现质粒污染，应采取物理隔离措施，避免在PCR反应体系配置区取用。

表1 10种检疫性有害生物检疫鉴定方法

Table 1  Quarantine and identification methods for 10 quarantine pests

表2 10种检疫性有害生物衔接引物

Table 2  Primers for 10 quarantine pests

M：DNA Marker(分别为100 bp、250 bp、500 bp、750 bp、1000 bp、2000 bp)；泳道1是Pspp，272 bp；泳道2是Psm，670 bp；泳道3是Bs，400 bp；泳道4是PsG，329 bp；泳道5是FT，655 bp；泳道6是FV，452 bp；泳道7是BSR-A，1020 bp；泳道8是PspG，500 bp；泳道9是Cff，306 bp；泳道10是PSTVd，360 bp

图3 重组质粒的验证

Fig.3  Verification of recombinant plasmid

图4 质粒图谱

Fig.4  Plasmid profile

参考 文献

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（文章类别：CPST-B）