曹丙蕾1 刘 敏1 张 群1 王 飞1 王 群2

牛白血病又称牛地方流行性白血病（Enzootic bovine leukosis，EBL），是由牛白血病病毒( Bovine leukemia virus，BLV)引起的一种慢性肿瘤性疾病^[1]，该病最早于1878年在德国发现，1974年我国首次在上海发现该病，此后逐渐扩散到全国其他省市^[2]。EBL是OIE的B类动物传染病，也是我国的二类动物传染病^[3-4]。

BLV是一种RNA病毒，以前病毒cDNA的形式存在于细胞染色体中，与细胞DNA同步复制^[5]。该病毒的结构蛋白有多种，大多数都可作为免疫原，其中gp51具有较强的免疫原性，能在感染动物体内产生引起强烈的免疫反应，是一种理想的诊断抗原^[6]。

近几年来，我国从澳大利亚、新西兰、乌拉圭等国家引进种牛数量急剧增多，进境种牛疫病检测国际上常用ELISA方法作为通用检测方法，目前在口岸动物疫病筛查中常用的ELISA试剂盒主要还是依靠国外进口，价格昂贵，使用成本高。为解决EBL抗体检测的“卡脖子”技术，本研究选取BLV的gp51蛋白基因为研究对象，构建该蛋白基因的原核表达载体，并进行重组gp51蛋白的表达纯化，利用重组蛋白建立间接ELISA抗体检测方法，并与国外进口同类试剂盒进行比对，验证所建立的ELISA方法的有效性及实用性。

1 实验部分

1.1 材料

1.1.1 生物材料

试验中所用到的血清样本（牛白血病、牛病毒性腹泻-黏膜病、牛副结核分枝杆菌、赤羽病等阳性血清及阴性血清）均来自2020—2021年从新西兰、澳大利亚和乌拉圭等国家经东营和滨州口岸进境隔离的种牛，经本实验室血清分离后进行疫病检测筛查并保存备用。BLV羊胎肾细胞培养物由本实验室保存备用。牛白血病标准阳性血清和阴性血清由西班牙INGENASA（批号200420）提供。

1.1.2 主要试剂

Premix Taq™ Mix、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ等试剂购自TaKaRa公司；HRP-兔抗牛IgG、显色液等购自北京博奥森公司；磁珠法核酸提取试剂盒购自天根生化；进口牛白血病EBL抗体检测试剂盒购自法国ID VET、美国IDEXX、西班牙INGENASA。其他试剂配制按照常规方法获得。

1.1.3 主要仪器

基因扩增仪（TC-96/G/H）、凝胶成像系统（GenoSens 2100）、酶标仪（Bio-Rad 680）等。

1.2 方法

1.2.1 编码gp51蛋白基因的扩增分析

从GenBank中已公布的BLV全基因序列中筛选保守性较强的编码gp51蛋白的基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物gp51-F1：5'- CGGAATTCTGGAGATGCTCCCTGTCC-3'，下划线处为酶切位点EcoRⅠ；gp51-R1：5'- GCAAGCTTACGTCTGACCCGGGTAGG-3'，下划线处为酶切位点HindⅢ，预期片段长度约为819 bp，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

利用磁珠法核酸提取试剂盒从BLV细胞培养物中提取BLV核酸，以提取BLV的cDNA为模板，利用gp51-F1和gp51-R1引物进行PCR扩增^[7]。反应体系和反应程序按照Premix Taq™ Mix反应试剂盒进行，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析后进行测序分析。

1.2.2 重组表达载体的构建、表达及纯化

PCR产物与载体pET-32a进行连接，连接产物转化至E.coli Rosetta感受态细胞中，经PCR和酶切鉴定获得重组表达质粒pET-32a-BLV-gp51。挑选单个阳性菌落至2ⅹYT液体培养基中，在1%IPTG的作用下进行诱导表达，离心收集表达菌进行SDS-PAGE分析^[8-9]。重组表达菌通过Ni-NTA亲和层析获得纯化重组BLV-gp51蛋白，经Bradford测定蛋白浓度并进行SDS-PAGE分析和Western blot分析^[8-9]。

1.2.3 间接ELISA检测方法的建立及优化

碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释纯化BLV-gp51蛋白抗原至酶标板中，100 μL/孔，4℃过夜包被；洗涤，缓冲液37℃封闭；洗涤，加入稀释的待检血清，100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗涤，加入稀释的HRP-兔抗牛IgG，100 μL/孔，37℃孵育30 min；洗涤后加入TMB底物显色液，100 μL/孔，室温避光显色，加入2 mol/L H₂SO₄终止反应，ELISA板置于酶标仪中读取OD₄₅₀ nm值^[9]。

（1）酶标二抗最佳稀释比例的确定

对BLV阳性对照及阴性对照进行1:100稀释，加入酶标板中进行包被（100 μL/孔），洗涤后将HRP-兔抗牛IgG按1:500、1:1000、1:2000和1:5000进行系列稀释，设立复孔，进行ELISA检测，酶标仪读取OD₄₅₀ nm，以阳性OD₄₅₀ nm/阴性OD₄₅₀ nm（P/N比值）的比值最大作为优化依据。

（2）抗原抗体最佳稀释比例的确定

利用方阵滴定法确定抗原抗体最佳稀释浓度。按照2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、10 μg/mL的比例对gp51蛋白进行稀释，加入酶标板中包被（100 μL/孔），洗涤后将BLV阳性对照及阴性对照分别按1:20、1:50、1:100的比例进行稀释，二抗采用所确定的稀释比例进行ELISA检测，设立复孔，酶标仪读取结果后，以P/N比值作为优化依据。

（3）封闭缓冲液的确定

以含5%脱脂奶粉、1% BSA、10%胎牛血清的PBST缓冲液分别作为封闭液，在37℃恒温下，封闭时间分别设为15 min、30 min、60 min，ELISA检测读取结果后，筛选最优封闭缓冲液及作用时间。

（4）底物最佳作用时间的确定

在已确定的反应条件下进行ELISA检测，加入底物溶液后分别在反应时间5 min、10 min和15 min时终止反应，酶标仪读取结果后，以P/N比值作为优化依据。

（5）阴阳性判定标准的确立

对20份已知的BLV标准阴性对照和10份BLV标准阳性对照进行ELISA检测，分析ELISA试验成立有效条件，设置阴阳性判定标准：以待检样本OD₄₅₀ nm值/阴性样本OD₄₅₀ nm平均值的比值作为Cut-off值（以S/N表示），若S/N≥2.1为阳性，则1.5＜S/N＜2.1为可疑，S/N≤1.5为阴性。

（6）重复性试验

选取已知的5份BLV阳性对照和2份BLV阴性对照，每份血清设置5个平行孔，分别在3个不同的检测时间（0 d、1 d、2 d）下进行ELISA检测，进行批内与批间重复性分析。

（7）灵敏性试验

阳性血清按1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800等进行倍比稀释，进行ELISA检测，确定方法的检测低限即灵敏度。

（8）特异性试验

对BLV阳性血清、BVDV阳性血清、牛副结核分枝杆菌阳性血清和赤羽病阳性血清等样本进行ELISA检测，并设阴阳性对照，分析该ELISA方法检测特异性。

1.2.4 ELISA检测应用

按上述确定的ELISA方法对12份待检血清进行检测，同时设阴阳性对照，设立复孔，分析ELISA在实际应用中的检测情况。

1.2.5 与进口同类检测试剂盒的验证比对

从来自新西兰、澳大利亚和乌克兰等的进境种牛血清中，选取具有代表性的180份血清，采用1.2.3中确定的方法进行抗体检测，同时采用法国ID VET、美国IDEXX和西班牙INGENASA这3家公司的EBL抗体检测试剂盒进行同步检测，对检测结果进行验证比对，验证本方案检测方法的适用性及应用性。

2 结果

2.1 gp51基因的PCR扩增及序列分析

gp51基因经PCR扩增后获得819 bp的条带，与预期片段大小一致，如图1所示，测序结果表明，该扩增序列与预期目的片段核苷酸同源性为100%。

利用MegAlign软件对gp51基因序列与GenBank已公布的15株国内外毒株的gp51序列进行比较分析，BLV-gp51蛋白基因序列高度保守，核苷酸同源性达到98.1%～100%，氨基酸同源性达到97.9%～99.7%。

2.2 重组表达载体pET-32a-BLV-gp51的鉴定分析

重组质粒PCR鉴定（图略）和双酶切鉴定，如图2所示，均证实成功构建了重组表达载体pET-32a-BLV-gp51。

a: gp51蛋白基因; M: GeneRuler DNA Ladder Mix

图1 BLV-gp51蛋白基因的PCR扩增结果

Fig.1 The results of PCR of the gene of gp51 protein of BLV

b: 双酶切结果; M: GeneRuler DNA Ladder Mix

图2 重组质粒pET-32a-BLV-gp51的双酶切鉴定结果

Fig.2 The results of the double enzyme digestion of the recombinant plasmid pET-32a-BLV-gp51

2.3 重组gp51蛋白的鉴定分析

SDS-PAGE电泳分析（图3）表明，重组表达菌获得了分子量大小约为47kDa的重组蛋白，以融合蛋白的形式存在，经亲和层析纯化后获得纯化蛋白（浓度约为196 μg/mL）。

Western blot分析（图4）表明，重组gp51蛋白与BLV阳性血清在约47kDa处发生免疫反应，与其他无关血清样本（如BVDV、M.pt、AKAV，图略）不发生免疫反应，说明重组gp51蛋白具有良好的反应原性和特异性。

M: 蛋白质分子量标准; 1: 重组表达菌; 2～4: 纯化gp51蛋白

图3 重组表达蛋白SDS-PAGE分析

Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

M: 蛋白质分子量标准; 1: 纯化gp51蛋白印迹

图4 重组gp51蛋白的Western blot分析

Fig.4 Western blot analysis of recombinant gp51 protein

2.4 ELISA检测方法的建立

2.4.1 酶标二抗优化条件的确定

酶标二抗优化结果如表1所示，在1:5000的稀释比例下，P/N比值为9.38，均高于其他稀释比例下的P/N比值，可作为酶标二抗的最佳稀释比例。

2.4.2 抗原抗体优化条件的确定

通过方阵滴定法确定了ELISA检测中抗原抗体的优化反应条件，如表2所示，在抗原包被浓度2 μg/mL，血清稀释比例为1:100时，P/N比值为13.58，均高于其他稀释比例下的P/N比值，可作为抗原抗体优化的最佳稀释比例。

表1 HRP标记兔抗牛IgG稀释比例的优化

Table 1 Optimization of dilution ratio of HRP labeled rabbit anti-bovine IgG

表2 抗原抗体稀释比例的优化

Table 2 Optimization of dilution ratio of the antigen and antibody

2.4.3 封闭缓冲液的确定

结果表明，在使用含5%脱脂奶粉和1% BSA的PBST缓冲液时，P/N比值分别为9.66和9.55，两者差异不明显，考虑到使用成本问题，以含5%脱脂奶粉的PBST缓冲液来作为封闭液使用最为理想，作为样品稀释液使用效果也较好。

2.4.4 底物作用时间的确定

优化结果如表3所示，在底物显色15 min时，可获得P/N最大比值，此时的信号/背景比较高，显色效果最为理想。

2.4.5 阴阳性判定标准

经检测，20份阴性对照的OD₄₅₀ nm为0.120，10份阳性对照的OD₄₅₀ nm为1.567，每份阳性对照S/N值均＞2.1，判定为阳性，每份阴性对照S/N值均＜2.1，判定为阴性，阴阳性判定标准与已知既定结果保持一致，且每次检测时需同时加入阴阳性对照作为质控，试验成立有效。

表3 底物显色的最佳作用时间

Table 3 The optimal time of the substrate reaction

2.4.6 重复性结果

如表4和表5所示，批内重复性结果变异系数在3.5%～9.0%之间。不同时间的同一批样品批间重复性结果变异系数在1.3%～6.2%之间，均小于10%，所建立的ELISA方法重复性较好。

表4 批内重复性试验

Table 4 Intra-batch repeatability test

表5 批间重复性试验

Table 5 Inter-batch repeatability test

2.4.7 灵敏性试验

结果表明，当血清稀释倍数达到1:3200、1:6400、1:12800时，S/N值分别为2.43、2.01、1.77，分别判定为阳性、阴性、阴性，故血清效价测定为1:3200，检测方法灵敏性较好。

2.4.8 特异性结果

结果表明，阳性血清OD值为1.125，阴性OD值为0.119，S/N为9.45＞2.1，判为阳性，而其他无关血清样本OD值平均为0.159，结果均为阴性，所建立的ELISA方法对BLV的检测具有较好的特异性。

2.5 ELISA检测应用结果

对12份待检血清检测结果分析如表6所示，结果表明有8份样品是阳性，有4份无关血清样品是阴性，所建立的ELISA方法灵敏度较高，特异性好，免疫反应较好。

表6 间接ELISA方法测定BLV血清抗体结果

Table 6 The results of indirect ELISA for BLV antibody

2.6 不同试剂盒的验证比对结果

从表7中的结果可知，本研究ELISA抗体检测结果与商品化试剂盒检测结果符合率较高，达到97.8%以上，变异较小，检测结果等效于同类型商品化BLV抗体检测试剂盒，且阳性检出情况较为稳定可靠，特异性较好，灵敏性较好，具有较好的应用效果。

表7 同类型BLV抗体检测试剂盒结果比对

Table 7 Comparison of results of the same type of BLV antibody detection kit

3 讨论

目前，牛白血病已成为进境种牛疫病检测的重要传染病之一，属于国门生物安全重点监测疫病之一，且在国内奶牛及种牛养殖场中也成为引起牛病的主要疾病之一。随着我国进境种牛数量的逐渐增加，牛白血病给我国进境动物疫病防控带来了极大挑战，严格遵循预防为主的动物疫病防控理念，及时对具有潜在跨境传播风险的动物进行疫病检测是控制EBL流行的前提，而血清学诊断方法是诊断EBL的常用检测方法，是国际贸易中进境大宗动物公认的通用检测方法^[10]。

由于BLV病毒是以前病毒cDNA的形式存在于细胞染色体中，本研究以含有持续性感染EBL的羊胎肾细胞提取核酸DNA为模板，以gp51蛋白为诊断抗原进行研究，建立了间接ELISA检测方法用于BLV抗体检测，并在进境种牛血清检测中获得了较好的应用，与同类型商品化检测试剂盒在检测结果上符合率较高，特异性好，灵敏度较高，不同品牌的检测试剂盒之间结果差异较小，之所以阳性结果会有一些差别，是由于不同品牌的方法和结果判定标准有所差异而造成的。

4 结论

本研究从根源出发，建立行之有效的检测技术平台，及时有效地进行疾病筛查，给进境种牛的隔离检疫提供准确可靠的数据支持，为下一步其他动物疫病检测技术的建立及应用提供技术储备，可以有效防控外来动物疫病的扩散，保障国门生物安全，而且节省了检测成本，具有较好的推广应用价值。

kDa

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（文章类别：CPST-C）