史云鹏1 林萍萍1 安鹏天1 任欢欢1 雷早娟1 陈宝喜1 赵玉新

Abstract To compare the advantages and disadvantages of ELISA kit and AGID kit of Epizootic hemorrhagic disease (EHD), we tested ID and KE kits which belong to ELISA and XI and VM kits which belong to AGID with serums diluted in the range of 1:2 to 1:512. Positive, weak positive and negative serums were all included. Then 500 bovine serums which were part of retained samples were examined with known results. The results were as follows: outcomes of XI and ID kits became negative when the positive serum dilution came to 1:16, 1:64 respectively. Results of ID and KE kits turned to negative after 1:32, 1:128 of positive serum dilution respectively. However, the test results of KE kits in the 1:128 dilution were inconsistent. The RSD of ID and KE were in the range of 1.19%-9.48% and 0.55%-241.5%, whice means KE had better sensitivity than ID but poor repeatability. In the research of 500 bovine serums, KE was the only kit which had 7 false positives. Therefore, ELISA is more sensitivity than AGID and ID has better repeatability than KE in EHD testing of bovine serums.

Keywords EHD; ELISA; AGID; antibody kit; comparative experiment

鹿流行性出血病（ Epizootic hemorrhagic disease ， EHD ）是由呼肠孤病毒科环状病毒属的鹿流行性出血热病毒引起的虫媒传染病 ^[1] 。 1955 年 8 月，鹿流行性出血病首先在美国新泽西州暴发 ^[2] ，此病可引起白尾鹿、麋鹿等反刍动物体温升高、呼吸困难、黏膜和浆膜面出血、昏迷甚至死亡。 EHD 为世界动物卫生组织（ OIE ）规定的法定报告传染病。 EHDV 的流行与分布和蓝舌病病毒（ Bluetongue virus ， BTV ）相似，广泛分布于北纬 49° 到南纬 35° 之间 ^[3] 。

EHDV感染的诊断包括病毒学检测和血清学检测，其中血清学检测方法包括琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）和酶联免疫吸附试验（ELISA）^[4]。本文使用针对上述两种血清学方法的4种试剂盒对不同稀释梯度的血清和进境种牛血清样本进行检测，分析其检测效果，对比不同方法的血清检测试剂盒在进境种牛疫病检测中的适用性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待检血清

5份强阳性血清、5份弱阳性血清和5份阴性血清均由原云南出入境检验检疫技术中心动物检验检疫实验室提供。500份已知检测结果的血清样本为2018年进境种牛血清留存样品(采用PCR方法确认为阴性血清）。

1.1.2 检测试剂盒

鹿流行性出血热病毒VP7蛋白抗体竞争ELISA检测试剂盒（以下简称ID ELISA）购自ID公司，批号D88；鹿流行性出血热病毒抗体c-ELISA检测试剂盒（以下简称KE ELISA）购自KE公司，批号18073；鹿流行性出血病琼扩抗体检测试剂盒（以下简称XI AGID）购自云南晓旭生物科技有限公司，批号190451；蓝舌病病毒抗体检测试剂盒（以下简称VM AGID）购自VMRD公司，批号332。

1.2 检测方法

1.2.1 ID ELISA

在已包被鹿流行性出血热病毒VP7重组蛋白抗原板中每孔加入50 μL样品稀释液，设立阴阳性对照孔各2孔，每孔分别加入20 μL阴阳性对照，其余各孔加入待检血清样品；贴膜，微量振荡混匀，生化培养箱21℃孵育45 min；弃液，加入300 μL洗涤液洗涤每个板孔3次，拍干；每孔加入100 μL工作浓度的酶标抗体，微量振荡混匀，生化培养箱21℃孵育30 min；弃液，加入300 μL洗涤液洗涤每个板孔3次，拍干；加入100 μL底物液，21℃避光孵育15 min；加入100 μL终止液终止显色反应，使用酶标仪在450 nm波长读取OD值。

1.2.2 KE ELISA

阴阳性对照孔各2孔，每孔分别加入50 μL阴阳性对照，其余各孔加入35 μL样品稀释液，再加入15 μL血清样品，所有孔加入50 μL单抗；贴膜，微量振荡混匀，生化培养箱37℃孵育30 min；弃液，加入250 μL洗涤液洗涤每个板孔5次，拍干；每孔加入100 μL工作浓度的酶标记物，微量振荡混匀，生化培养箱37℃孵育30 min；弃液，加入250 μL洗涤液洗涤每个板孔5次，拍干；加入100 μL底物液，21℃避光孵育15 min；加入100 μL终止液终止显色反应，使用酶标仪在450 nm波长读取OD值。

1.2.3 XI AGID

在1%琼脂糖凝胶平皿上打孔，中间1 孔，周围6 孔为一组，如图1；每孔加25 μL，1、3、5孔加血清样品；2、4、6孔加EHDV阳性血清；中心孔加EHDV琼扩抗原；加样后静置5 min，再移入22～25℃的生化培养箱中，孵育24～48 h后观察结果。

图1 琼脂糖凝胶梅花型孔

Fig.1 Agarose gel plum blossom hole

1.2.4 VM AGID

过程同XI AGID，但每孔加样20 μL。

1.3 AGID方法和ELISA方法抗体检测试剂盒灵敏度试验

用AGID方法下的VM试剂盒、XI试剂盒和ELISA方法下的ID试剂盒和KE试剂盒分别检测已知背景血清6份，其中强阳性、弱阳性以及阴性血清各2份，血清稀释至1:512，每份血清样品做5个重复。

1.4 ELISA方法中ID和KE抗体检测试剂盒重复性试验

批号D88的ID试剂盒和批号18073的KE试剂盒检测强阳性血清，血清样品做5个重复。根据灵敏度试验检测结果，ID试剂盒检测稀释至1:64的强阳性血清，KE试剂盒检测稀释至1:256的强阳性血清，阴性血清稀释至1:256。

2 结果

2.1 AGID方法和ELISA方法抗体检测试剂盒灵敏度试验

AGID方法下的VM试剂盒无法检测出稀释后的强阳性及弱阳性血清，XI试剂盒只能检测出稀释至1:8的强阳性血清而无法检测出稀释后的弱阳性血清。ELISA方法下的ID试剂盒能够分别检测出稀释至1:32的强阳性血清和1:8的弱阳性血清，且重复样品间检测结果一致。KE试剂盒能够分别检测出稀释至1:128的强阳性血清和1:16的弱阳性血清，但检测结果不一致，即当检测1:64和1:128稀释的强阳性血清时，分别出现少量复孔阴性和个别复孔阳性的结果，故在表1的注释中将“＋”解释为“可检出阳性结果”；当检测1:16稀释的弱阳性血清时，出现个别复孔阴性的结果。检测结果见表1。

表1 强阳性和弱阳性稀释血清的试剂盒检测结果

Table 1 Kit test results of strongly positive and weakly positive diluted serum

2.2 ID和KE抗体检测试剂盒重复性试验

KE试剂盒在1:128稀释度下呈现4个阳性，1个阴性结果；在1:256稀释度下全阴性，整体RSD在0.55%～241.5%之间。ID试剂盒在1:32稀释度下呈现一致的阳性，但在1:64稀释度下出现3个可疑结果（按试剂盒说明书进行结果判定），整体RSD在1.19%～9.48%之间，阴性血清检测结果均为阴性。检测结果见表2、表3。

2.3 AGID方法和ELISA方法检测结果比较

用AGID方法下的VM试剂盒、XI试剂盒和ELISA方法下的ID试剂盒和KE试剂盒对500份进境种牛血清进行检测，结果见表4和表5。

ELISA方法下的ID试剂盒、KE试剂盒与AGID方法下的VM试剂盒、XI试剂盒检测结果比较，两种方法中同为阴性的血清为493份，其中AGID方法下的两种试剂盒检测结果完全一致，均为阴性，符合率是（0+500）/500×100%＝100%，但ELISA试剂盒检测结果存在差异，ID试剂盒检测结果均为阴性，KE试剂盒检测结果出现7份假阳性，二者的符合率是（0+493）/500×100%＝98.6%。

表2 KE试剂盒强阳性稀释血清重复性试验结果

Table 2 Reproducibility test results of KE kit for strong positive serum samples

表3 ID试剂盒强阳性稀释血清重复性试验结果

Table 3 Reproducibility test results of ID kit for strong positive serum samples

表4 基于AGID方法的VM和XI试剂盒对500份血清的检测结果

Table 4 Test results of 500 serum samples by VM and XI kits based on the AGID method

表5 基于ELISA方法的ID和KE试剂盒对500份血清的检测结果

Table 5 Test results of 500 serum samples by ID and KE kits based on the ELISA method

3 讨论

在琼脂凝胶免疫扩散试验中，当待检血清中的抗体浓度较低时，不足以在琼脂中产生肉眼可见的抗原-抗体沉淀线且判读过程相对主观，但该方法操作简便，不需要特殊设备，检测成本低廉^[5]。酶联免疫吸附试验中，即使存在微量的抗原或抗体也会被吸附在固相载体上的抗体或抗原特异性结合。通过酶联反应逐级放大后，最终通过酶标仪测定对应吸光度下的OD值，从而判定结果的阴阳性。该方法排除了肉眼判断的主观性，但实验过程中需要微孔板振荡器、洗板机、酶标仪等特殊设备。

在重复性试验中，ID较KE的RSD范围小得多，整体都在10%以下。虽然RSD的最低值较KE大，但整体分布比较均匀，重复性较好。分析ID的RSD最低值较高的原因是，其S/N的比值均为小于1的小数，即使数值有百分之一的变化，对RSD的计算也会有较大影响。对于KE而言，结果判定中计算的PI值即使数值之间相差3或4，其RSD值也在2%以下（见表4中1:8稀释度下对应的RSD值）。虽然ID的灵敏度较KE低，但当检测到1:32的临界稀释度时，其检测的结果为统一的阳性，不存在可疑或阴性的结果。KE则在临界稀释度1:128时出现两种截然相反的结果，且PI值相差甚远。当对500份种牛血清进行检测时，虽然KE试剂盒具有更高的灵敏度，但其可能与血清中的某些非特异性物质结合，从而产生了7个假阳性结果。

4 结语

通过以上试验结果显示，4种试剂盒中ID 试剂盒的稳定性、重复性、准确性均较好，且检测时长缩短至3 h，因此可用于大规模样品的检测。目前与琼扩试验相比，海关在进行进境种牛鹿流行性出血病检测时，采用的是琼脂凝胶免疫扩散试验，在实际检疫工作中，待检血清不仅数量大且有严格的检疫时间限制。因此非常需要一种灵敏度和准确度高、重复性好的试剂盒，不仅降低复检试验带来的人力和物力成本，更极大地减少时间成本，缩短通关时长。