耿昱琨1 张敏爱1 巩红霞1 刘 燕1 王丽梅1 巩政坤1

新型冠状病毒肺炎疫情暴发后，口罩等一次性使用卫生用品成为市面上的畅销产品，其卫生状况备受关注，其中微生物指标是卫生质量合格与否的重要影响因素^[1-2]。为适应疫情下市场的检测需求，提升检测能力水平，本中心实验室参加了一次性使用卫生用品中绿脓杆菌的检测能力验证。GB 15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》^[3]是一次性使用卫生用品检测的国家强制标准，其中明确规定了口罩（普通级/消毒级）中不得检出致病性化脓菌^[3-4]，绿脓杆菌就是其中一项重要指标，同时在附录B4中详细描述了产品的微生物学检测方法^[3]。

绿脓杆菌又称铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），属于假单胞菌属，在自然界中广泛分布，对外界环境的抵抗力较强，是一种重要的条件致病菌，可引起人的眼、耳、鼻、咽喉和皮肤等处感染，特别是烧伤、烫伤后的感染尤为严重，常使病情恶化，并可引发败血症。该菌为革兰阴性杆菌，氧化酶阳性，能产生绿脓菌素，还能液化明胶，还原硝酸盐为亚硝酸盐，在42℃条件下能生长，可与类似菌区别^[5-8]。

参加能力验证过程中，按照能力验证作业指导书^[9]和GB 15979-2002中附录B4的要求进行增菌、分离和鉴定。菌种鉴定还参考了绿脓杆菌检测的其他标准 ^[10-11]。这些标准的菌种鉴定都以手工生化试验为主要鉴定方法，但以往检测绿脓杆菌的经验表明，绿脓杆菌的菌型多，不同菌型在相同的选择性平板上呈现出不同形态，也会表现出不同的手工生化鉴定结果。为确保鉴定结果的准确性，增加了全自动微生物生化鉴定系统^[9]和PCR-荧光探针^[12-14] 2种鉴定方法。此外，选择4株绿脓杆菌分离菌株对3种鉴定方法^[15]进行验证，分析整个检测过程的关键环节，探讨影响鉴定结果的可能因素，实现对一次性使用卫生用品中绿脓杆菌检测结果的质量控制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 待测样品

样品2份，编号分别为20DP-2112、20DP-1630，由中国海关科学技术研究中心提供。

1.1.2 菌株

标准菌株：阳性对照选用绿脓杆菌ATCC27853；阴性对照选用荧光假单胞菌ATCC13525。菌株购自美国菌种保藏中心，由本实验室保存。

分离菌株：4株绿脓杆菌，由本实验室从污染饮用水样品中分离，分别为A～D，其中，A、B株于2018年4月纯化保藏至-20℃冰箱中，C、D株于2020年9月纯化保藏至-20℃冰箱中。

1.1.3 培养基和试剂

营养肉汤、SCDLP液体培养基、十六烷三甲基溴化铵琼脂、乙酰胺琼脂、CN琼脂、假单胞显色培养基、革兰氏染液试剂盒、氧化酶试剂、绿脓菌素测定培养基、硝酸盐胨水培养基、明胶培养基、营养琼脂培养基，均购自北京陆桥技术股份有限公司；VITEK2 革兰氏阴性细菌鉴定GN卡购自法国生物梅里埃公司；细菌基因组 DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；绿脓杆菌核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）购自广州达安基因股份有限公司。

1.1.4 仪器设备

生物安全柜、恒温培养箱、显微镜、全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）、荧光PCR仪。

1.2 检验方法

按照“一次性使用卫生用品中致病菌的检测”（CNCA-20-12）参试指导书和GB 15979-2002的要求进行增菌、分离和手工生化鉴定。除此之外，增加了全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）和荧光PCR仪对可疑菌落进行鉴定，综合以上3种试验的检测结果出具报告，检验流程如图1所示^[9]。其中，以绿脓杆菌ATCC27853作为阳性对照菌株，以荧光假单胞菌ATCC13525作为阴性对照菌株。

图1 绿脓杆菌检验流程

Fig.1 The inspection procedure of Pseudomonas aeruginosa

1.2.1 样品制备

无菌开启2个样品包装，瓶内样品为含菌口罩，直接用于检测，在生物安全柜中剪碎后，分别与100 mL无菌生理盐水进行充分混匀，均质2 min。此溶液即待测样液，编号分别为20DP-2112、20DP-1630。

1.2.2 增菌

取2个能力验证样品待测样液各5 mL，分别加到50 mL SCDLP液体培养基中，充分混匀，置于（35±2）℃培养18～24 h。同时，分别取阳性对照绿脓杆菌ATCC27853、阴性对照荧光假单胞菌ATCC13525和4株分离菌株菌液1 mL（50～100 CFU/mL）接种至50 mL SCDLP液体培养基中进行培养。

1.2.3 选择性分离

从增菌培养液中挑取培养物划线接种于十六烷三甲基溴化铵琼脂，置于（35±2）℃培养18～24 h。除此之外，还增加了乙酰胺琼脂、CN琼脂和假单胞显色培养基这些选择性平板，除CN琼脂培养48 h外，其余都培养24 h。同方法操作阳性对照、阴性对照和4株分离菌株，观察菌落特征。

1.2.4 生化反应试验

从选择性平板上选取典型菌落，分别分离纯化至营养琼脂平板上，于36℃培养24 h。挑取单菌落涂片进行革兰氏染色、镜检，并分别进行氧化酶试验、绿脓菌素试验、硝酸盐还原产气试验、明胶液化试验和 42℃生长试验。

1.2.5 全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）鉴定

挑取经革兰氏染色镜检为革兰氏阴性菌的单菌落，用GN鉴定卡，采用全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）进行鉴定。

1.2.6 PCR-荧光探针法试验

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取能力验证样本分离菌株、4株实验室保存的分离菌株和绿脓杆菌ATCC27853的核酸。然后，进行2组试验：第1组为能力验证组，第2组为分离菌株组。将能力验证样本核酸、分离菌株样本核酸、处理后的核酸检测试剂盒阴性质控品、阳性质控品5 μL分别与绿脓PCR反应液A液17 μL、B液3 μL混合成25 μL的绿脓扩增体系。按照50℃ 2 min、95℃ 15 min、94℃ 15 s、55℃ 45 s，循环40次的扩增参数进行扩增。

2 结果与分析

2.1 增菌和选择性分离

增菌及选择性分离的结果描述见表1。

用SCDLP液体培养基在（35±2）℃增菌培养18～24 h后，多数培养液通常出现混浊，呈菌悬液状，只有少数培养液会出现标准所说的表面呈现一层薄菌膜， 颜色变为黄绿色或蓝绿色。在进行分离培养时，标准中描述的绿脓杆菌在十六烷三甲基溴化铵琼脂上生长时，会使菌落周围培养基略带粉红色，但实际情况中菌落周围培养基依然是琼脂本色，很少出现略带粉红色的情况。因此，不能以颜色来判定是否有绿脓杆菌，还需进行后续试验进行确证^[16]。

标准中的选择性平板只有十六烷三甲基溴化铵琼脂，因此增加了多种绿脓杆菌选择性平板，如乙酰胺琼脂、CN琼脂和假单胞显色培养基，以提高绿脓杆菌的检出率。其中，乙酰胺培养基的选择性强，大多数杂菌在乙酰胺培养基上不生长，据此可将乙酰胺培养基分离菌落这个步骤作为增菌后初步判定是否有目标菌的有效方式^[6]。

2.2 手工生化反应试验

手工生化反应试验结果见表2。

手工生化鉴定时对照至关重要，是结果准确性的有效保证，同时试剂的使用和质量也是试验成立与否的关键因素。例如：氧化酶试验是绿脓杆菌手工生化试验中关键的一步，若氧化酶阴性即可认定为非绿脓杆菌。但氧化酶试剂中1%二甲基对苯二胺在使用过程存在较高不稳定性，保质期短，且保存需严格避光，操作不当会存在假阳、假阴的结果。因此，必须用已知氧化酶阳性和阴性的菌株进行比对，以排除试验的不利影响因素^[16]。

由于微生物具有容易变异的特性，实际生化试验中，会出现判定为绿脓杆菌的分离菌株试验结果不符合典型的阳性特征。例如：标准菌株的明胶液化试验呈阳性，而分离菌株D的明胶液化试验并没有呈现阳性特征。这是由于明胶液化的快慢与绿脓杆菌的生长所产生的明胶液化酶有关，而绿脓杆菌的生长又与多种因素有关。因此，分离菌株明胶液化不明显可能与其产生明胶液化酶不足有关。

2.3 全自动微生物生化鉴定系统（VITEK2-Compact）鉴定结果

对样品进行全自动微生物生化鉴定，结果见表3。

表3 全自动微生物生化鉴定系统试验结果

Table 3 Test results of automatic microbial biochemical identification system

2.4 PCR-荧光探针法试验检测结果

能力验证样品PCR-荧光探针法检测结果如图2所示。

分离菌株PCR-荧光探针法检测结果如图3所示。

图2和图3的结果显示，20DP-1630分离菌株1和2、分离菌株A、B、C、D、绿脓杆菌ATCC27853、核酸检测试剂盒阳性质控品的Ct值≤38，且呈现出明显的扩增曲线，可判定为绿脓杆菌阳性。

3 结论

在手工生化试验中，少部分菌落未呈现出典型的生化特性，如分离菌株C中绿脓菌素、42℃生长试验为阴性；分离菌株D中绿脓菌素、明胶液化、42℃生长试验为阴性。如按照GB 15979-2002进行判定，分离菌株C、D均应报告未检出绿脓杆菌，但选择性平板增菌又显示出典型的绿脓杆菌菌落特征。为增加结果的准确性，同时采用了全自动微生物生化鉴定系统和PCR-荧光探针法对分离菌株C、D进行鉴定，都呈现出较明显的阳性结果。因此，在绿脓杆菌的检测过程中不能仅仅依靠手工生化试验来判定是否检出绿脓杆菌，还需增加全自动微生物生化鉴定和荧光PCR确证试验等多种方法来综合分析，防止误检漏检。

参考文献

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（文章类别：CPST-B）

Abstract In order to meet the demand for testing the sanitary conditions of disposable sanitary products during the COVID-19 pandemic and improve the detection capacity of Pseudomonas aeruginosa, we participated in "Verification of detection ability of Pseudomonas aeruginosa in disposable sanitary products". According to Hygienic standard for disposable sanitary products (GB 15979-2002 Appendix B4), the strains isolated from the proficiency testing samples and four isolates of Pseudomonas aeruginosa were identified by manual biochemical tests, automatic microbial biochemical identification system and PCR-fluorescence probe method. The results showed that no Pseudomonas aeruginosa was detected in sample 20DP-2112, Pseudomonas aeruginosa strains were isolated from sample 20DP-1630 and four strains A/B/C/D. Strains isolated from 20DP-1630 and two strains A/B showed excellent positive results by all the methods. The other two strains C/D showed weak positive characteristics by manual biochemical identification, but both automatic microbial biochemical identification system and fluorescence PCR instrument showed high positive coincidence rate, and comprehensive analysis can also be determined as Pseudomonas aeruginosa. Therefore, the detection of Pseudomonas aeruginosa should not only rely on the result of manual biochemical tests, but also need to combine with a variety of methods to achieve the quality control of the test results.

Keywords disposable sanitary products; Pseudomonas aeruginosa; quality control

表1 增菌及选择性分离结果

Table 1 Results of enrichment and selective isolation

表2 手工生化反应试验结果

Table 2 Results of manual biochemical reaction tests

荧光强度

循环数

1：20DP-1630分离菌株1；2：20DP-1630分离菌株2；

3：绿脓杆菌ATCC27853；4：阳性质控品；5：阴性质控品

图2 能力验证样品的扩增动力学曲线

Fig.2 Amplification kinetics curves of the proficiency testing samples

荧光强度

循环数

1：分离菌株A；2：分离菌株B；3：阳性质控品；

4：分离菌株C；5：分离菌株D；6：阴性质控品

图3 分离菌株扩增动力学曲线

Fig.3 Amplification kinetics curves of the isolated strains

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（文章类别：CPST-A）

第3卷 第11期

2021年11月

Applied Research / 应用研究