张吉红1 徐 瑛1 王佳莹1 陈先锋1*

银杏（Ginkgo biloba），银杏科银杏属植物^[1]，是集观赏、营养、生态和医药等功能于一体的植物。在我国1999年公布的《国家重点保护野生植物名录》（第一批）中，该树种被列入Ⅰ级国家重点保护野生植物^[2-3]。银杏全身是宝，树干可用于加工木材、绿化道路、制作盆景等，银杏果是传统药食两用食品，可加工成饮品、糕点等；叶片提取物和制剂可用于化妆品、药品、生物饲料及生物农药 ^[4]。

我国每年有大量银杏盆景出口，虽为人工栽培种，仍须向海关报检。盆景苗木进出口时间多为每年11月至次年2月，此阶段正处于植物的落叶期，不利于银杏等盆景的查验。另外，银杏在加工使用过程中存在掺假现象，其中，中药材掺假会对治疗效果产生影响，甚至会产生副作用^[5-6]。

目前，对银杏内酯、多糖、抗氧化肽等有效成分的检测鉴别方法是液相色谱、紫外光谱、质谱等波谱学方法，基于核酸分析技术对银杏性别、栽培品种等进行鉴别，以及对系统发育树和遗传多样性进行分析^[6-8]。孟菊等^[9]建立了银杏LAMP鉴定技术，可有效区分混伪品槐角和槐米。但该方法容易造成污染，在试验操作过程中需要采取相应的措施。目前，还没有银杏成分real-time PCR鉴定方法的报道。本文根据银杏的叶绿体基因trnS-trnG间隔区序列，建立了real-time PCR特异性鉴定方法，将为海关执法、CITES履约、中药材真伪鉴定以及林业管理等提供更加快速科学的技术支撑。

1  材料与方法

1.1 材料来源

试验所用植物材料部分来自宁波口岸入境的种苗，另外大部分采自南京、沈阳、杭州等地，均已经过相关专家的鉴定确认，共采集57份样品，其中2份为银杏样品（不同栽培种），见表1。样品保存于宁波海关技术中心实验室。白果粉、银杏奶茶、银杏晶、银杏叶粉等4份银杏制品购自淘宝。

1.2 主要试剂与仪器

TransStart Probe qPCR SuperMix（北京全式金生物公司）；核酸提取试剂DNeasy Plant Mini kit（69104）（凯杰公司）；采用ABI stepone plus荧光定量PCR仪测量实时荧光PCR；全自动核酸提取仪为QIAGEN QIAcube connect。

1.3 模板DNA提取

样品研磨打碎，取100 mg粉样于1.5 mL离心管中，加入CTAB提取液600 µL，充分振荡混匀；65℃水浴30 min，不时颠倒混匀；10000 r/min离心5 min，取上清，等体积氯仿（三氯甲烷:异戊醇＝24:1）抽提1次；取上清，再加入1200 µL的CTAB沉淀液，室温沉淀60 min，12000 r/min离心10 min，弃上清；加入350 µL NaCl溶液溶解沉淀，再用等体积氯仿抽提1次；取上清，加入相同体积的异丙醇，于4℃条件下放置10 min以上，12000 r/min离心10 min，弃上清；70%乙醇洗涤1～2次，待晾干后，加入100 µL TE缓冲液溶解核酸，4℃保存备用^[10]。也可用相应市售DNA提取试剂盒提取DNA。

1.4 引物与探针设计

在GenBank中获得已登录的银杏基因序列^[11]，先比对其同源性，采用BLAST程序测试，再选取在同源性序列中的高度保守区，随后设计银杏的特异性引物与探针，采用Primer Express 3.0软件，序列见表2。FAM荧光报告基团位于探针5′端，淬灭基团Eclipse位于3′端。采用SN/T 1204-2016中18S rRNA序列^[12]为内源基因。

表2  用于实时荧光PCR检测银杏的引物与探针

Table 2  Primers and probes for real-time PCR detection of Ginkgo biloba

1.5 内源基因检测

依据SN/T 1204-2016^[12]的标准，内源基因的Ct值应≤30才可进行后续试验。对提取的DNA模板进行real-time PCR测试，采用植物通用基因18S rRNA测试，待测样品出现典型扩增曲线，证明DNA提取成功；如未出现，说明DNA提取的质量出现问题，或DNA提取液中有某种因子存在抑制PCR反应，则需重新提取DNA，直至所有待测样品扩增出PCR产物。扩增条件同1.6所述。

1.6 实时荧光PCR扩增

real-time PCR反应体系：Probe qPCR Master Mix（2×）10 L；上游引物（10 mol/L）0.40 L；下游引物（10 mol/L）0.40 L；探针（10 mol/L） 0.80 L；ROX 0.4 L；DNA模板4.0 L；补水至20 L。

real-time PCR反应程序：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，运行40个循环。

1.7 特异性试验

分别提取来自银杏、雪松、侧柏、刺柏、水杉等28种植物采集的57个样品的核酸，并对其进行real-time PCR扩增检测，观察其反应体系的特异性。反应条件同1.6所述。

1.8 灵敏性试验

取银杏枝干提取的DNA，测定其DNA浓度，采用紫外分光光度法进行测量，对其DNA进行10倍梯度稀释，取不同浓度的DNA模板分别进行实时荧光 PCR检测。

1.9 银杏制品的检测

分别提取白果粉、银杏奶茶、银杏晶和银杏叶粉的核酸进行real-time PCR扩增。反应条件同1.6所述。

2  结果与分析

2.1 内源基因检测

对57份DNA模板进行real-time PCR检测，采用通用植物内源基因18S rRNA进行测试，所有样品均出现典型扩增曲线，且其Ct值在18～29之间。试验结果表明，所有样品DNA提取成功且符合要求，都可以进行后续的特异性试验及灵敏度试验，如图1所示。

图1  57份待测样品的内源基因实时荧光PCR扩增结果

Fig.1  Results of real-time PCR detection for 18S rRNA of 57 samples

2.2 实时荧光PCR检测特异性

银杏引物与荧光探针特异性研究表明，Y8、Y14的银杏样品出现典型的扩增曲线，而其他样品均未出现典型的扩增曲线，如图2所示。结合前文BLAST的特异性与同源性比较结果，这对引物与荧光探针在检测银杏方面具有良好的特异性。

图2  银杏的实时荧光PCR特异性扩增结果

Fig.2  Results of real-time PCR specific amplification of Ginkgo biloba

2.3 实时荧光PCR检测灵敏度

将银杏核酸提取出来后，测定其核酸浓度为1.3 ng/µL。将银杏的DNA基因组进行10倍系列稀释，用以检测灵敏度。采用real-time PCR方法检测。扩增结果表明，在核酸原液以及10^-1～10^-5倍的稀释液样本中均出现典型的扩增曲线，其Ct值分别为18.62、21.91、25.49、28.90、32.47和35.43，而在10^-6和10^-8 DNA稀释液样本中未出现典型扩增曲线，其试验结果为阴性，如图3所示。该灵敏度试验标准曲线的相关系数取0.996，如图4所示，检测限量取1.3×10^-5 ng/L。

2.4 银杏制品的检测

分别提取白果粉、银杏奶茶、银杏晶和银杏叶粉的核酸进行real-time PCR扩增，结果显示4份样品均扩增出典型曲线，Ct值分别为18.7、30.4、26.3和15.6，白果粉和银杏叶粉中银杏含量较高，银杏奶茶和银杏晶中的银杏含量较低，如图5所示。

图3  银杏的实时荧光PCR扩增结果标准曲线

Fig.3  Results of real-time PCR standard curve of Ginkgo biloba

图4  实时荧光PCR法检测银杏的灵敏度

Fig.4  Sensitivity of real-time PCR detection for Ginkgo biloba

3  结论

本试验采用凯杰的核酸提取试剂DNeasy Plant Mini kit（69104）可有效提取到银杏及白果粉、银杏奶茶、银杏晶等粗加工产品的核酸，但提取不到银杏深加工产品（如银杏叶提取物滴剂、银杏叶片等国药准字药品）的核酸。尝试采用传统的CTAB方法和凯杰的DNeasy mericon Food Kit（69514）试剂盒法，均无法提取到银杏深加工产品的核酸（数据未显示）。银杏是单纲、单目、单科、单属、单种植物，无法选取与其亲缘相近的植物比较，因此本试验选取了27种55个同为裸子植物的参试材料。

叶绿体基因trnS-trnG间隔区序列位于非编码区，在序列和结构上都相当保守，同时因其进化速率快，不同类群间差异较大，因而广泛应用于属下种间以及近缘属间的系统发育关系研究^[13]。本研究采用BLAST序列进行比对筛选，选取银杏trnS-trnG间隔区序列，设计开发了引物探针，用于针对银杏特异性，通过该引物探针可将银杏目、松杉目、红豆杉和松柏目等27种不同植物与银杏进行区分，表明其具有良好的特异性。本方法检测限量为1.3×10^-5 ng/L，与孟菊等^[9]建立的银杏LAMP检测方法灵敏度相当，具有很好的灵敏度。本方法的建立有助于规范进出口银杏幼苗、植株以及木材和成品监管，并可鉴定银杏制品的真伪，提高鉴定准确率，为口岸精准和快速鉴定提供了标准和依据。

基金项目：海关总署科研项目（2021HK160），宁波市科技计划项目（2019C10087）

第一作者：张吉红（1978—），女，汉族，山东商河人，博士，研究员，主要从事物种鉴定，E-mail: 1203064973@qq.com

通讯作者：陈先锋（1972—），男，汉族，浙江东阳人，博士，研究员，主要从事动植物检疫，E-mail: chenxianfeng@customs.gov.cn

1. 宁波海关技术中心  宁波检验检疫科学技术研究院  宁波  315012

1.  Ningbo Academy of Inspection and Quarantine, Ningbo Customs Technical Centre, Ningbo  315012

表1  试验材料

Table 1  Samples

表1（续）

图5  银杏制品的实时荧光PCR扩增结果

Fig.5  Results of real-time PCR detection for Ginkgo biloba products

参考文献

[1] 孙雪, 潘家坪. 江苏省邳州市银杏产业发展探讨[J]. 中国林业经济, 2020(1): 84-86.

[2] 邓辉洪, 曹浒, 徐雪娇, 等. 不同栽植密度对叶用银杏生长量及叶产量的影响[J]. 四川林业科技, 2021, 42(1): 102-108.

[3] 周昊, 王成章. 银杏资源加工利用产业发展现状[J]. 生物质化学工程, 2021, 55(1): 10-14.

[4] 刘秀萍, 臧恒昌, 于洪利. 银杏叶提取物的研究进展与应用前景[J]. 药学研究, 2014, 33(12): 721-723.

[5] 陆莉娟, 石晶萍, 洪丽萍, 等. 一种掺伪银杏叶提取物的初步分析鉴定[J]. 中国合理用药探索, 2017, 14(6) : 53-56.

[6] 何厚洪, 杜昕, 金辉辉, 等. 银杏叶提取物HPLC指纹图谱研究及共有峰的LC-MS鉴定[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(6): 1107-1112.

[7] 张扬, 朱胜男, 金晓芬, 等. 45S rDNA-FISH鉴定银杏雌雄性别[J]. 园艺学报, 2007, 34(6): 1520-1524.

[8] 沈永宝, 施季森, 赵洪亮. 利用ISSR DNA标记鉴定主要银杏栽培品种[J]. 林业科学, 2005, 41(1): 202-204.

[9] 孟菊, 马敏敏, 贾甜甜, 等. 银杏叶片DNA提取及PCR和LAMP鉴定技术[J]. 北方园艺, 20l8(24): 134-139.

[10] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 中国国家标准化管理委员会. 转基因产品检测 核酸提取纯化方法: GB/T 19495.3-2004 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2004.

[11] Lin C P, Wu C S, Huang Y Y. The complete chloroplast genome of Ginkgo biloba  reveals the mechanism of inverted repeat contraction[J]. Genome Biology and Evolution, 2012,4 (3): 374-381.

[12] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局, 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检测方法: SN/T 1204-2016 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2016.

[13] 董雷雷, 邢世岩, 李际红, 等. 叶籽银杏序列测定与分析[J]. 林业科学, 2008, 24(12): 168-172.

（文章类别：CPST-C）

第3卷  第11期

2021年11月

前沿科技 / Leading Technology