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芒果过敏原的初步鉴定及其热稳定性评价
作者:牟 瑶1 张宇航1 车会莲1*
牟 瑶1 张宇航1 车会莲1*
Preliminary Identification and Thermal Stability Evaluation of Mango Allergens
MOU Yao1 ZHANG Yu-Hang1 CHE Hui-Lian1*
Abstract The aim of this study was to preliminarily identify a mango allergen and to describe its thermal stability. By using phenol extracting method, mango crude proteins was extracted. The targeted allergen was then confirmed via Western blotting. LC-MS/MS was used to identify proteins in the band containing the targeted allergen, and the proteins that were most likely to correspond to it in NCBI was picked out from the result of mass spectrum via bioinformatics method. Finally, thermal stability test was performed followed by Western blotting to describe thermal stability of mango proteins and potential allergens and the law of their changes. Many potential allergens were found in mango, in which 34 kDa protein subunit could bind to specific antibodies in 5 single serums which were from people who suffered from immediate mango hypersensitivity, so it has the most value of identification. Beta-1, 3-glucanase and chitinase, partial are most likely to correspond to it. Thermal stabilities of mango proteins went down as their molecular mass went up. Changes in degree of sensitization of various mango potential allergens were different and complex as the heating duration went up. 34 kDa protein was found thermostable. Preliminary identification of 34 kDa mango allergen as well as the description of its thermal stability laid a foundation for its further identification and sensitization evaluation.
Keywords mango allergens; preliminary identification; 34 kDa; thermal stability
项目名称:北京市级大学生创新项目(bj202010019117)
第一作者:牟瑶(2000—),女,汉族,陕西人,本科在读,食品质量与安全专业,E-mail: miao_lovegood@163.com
通讯作者:车会莲(1977—),女,汉族,吉林人,博士,教授,从事食品营养与安全、食物过敏和特殊食品的研究,E-mail: chehuilian@cau.edu.cn
1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京 100083
1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083
芒果是一种营养价值较高的水果,具有抗氧化、抗癌、防治心脑血管疾病等功效[1]。但食用芒果也可能导致过敏。我国芒果过敏患者比例较高:Wu TC等的流行病学调查表明,芒果是台湾第四大主要过敏食物,当地食物过敏患者中芒果过敏发生率高达18.5%[2];吕波等对120 例儿童支气管哮喘患者进行了皮肤点刺试验,在91 例可检测出过敏原的哮喘儿童中,芒果过敏原阳性率高达57.1%[3]。
芒果过敏反应分为速发型和迟发型两类,分别由小分子物质和特异性蛋白质引发[4]。其中,速发型过敏反应可引起喘息性呼吸困难等症状[5],相较迟发型过敏危害更大。
过敏原系统命名法建立在过敏原鉴定基础上,是以蛋白质纯化或重组、分子识别和致敏性评价为主要流程,以标准化过敏原名称为目的的过敏原命名方法[6]。allergen.org是由世界卫生组织(WHO)/国际免疫学会联合会(IUIS)过敏原命名小组委员会组织的网站,提供了权威性过敏原线上数据库,按照上述流程被鉴定和命名的过敏原将被收录其中,为后续研究者提供便利。目前尚无任何芒果过敏原被收录于该库,其有关信息仅可在allergome.org、db.COMPAREdatabase.org等数据库中被找到,但它们的正规性与完整性有待考证。
综上所述,鉴定芒果中蛋白类过敏原并力求达到进入allergen.org数据库的要求十分必要。
本研究旨在初步鉴定一种芒果过敏原并描述其热稳定性。通过免疫学方法初步确定芒果中的34 kDa蛋白质为芒果过敏原之一,并结合液相色谱-串联质谱检测和生物信息学方法,从NCBI(ncbi.nlm.nih.gov)库中初步筛选出两种可能与之对应的蛋白质,为34 kDa芒果过敏原的鉴定提供基础。此外,将传统热稳定性试验与免疫学方法相结合,描述了芒果中潜在过敏原的热稳定性,为芒果过敏原的致敏性评价提供基础。
1 材料与方法
1.1 材料与主要试剂
芒果选用鹰嘴芒(漆树科,芒果树,鹰嘴芒种,购自中国农业大学东校区水果店)。
Tris-饱和酚(250 mL,北京拜尔迪生物技术有限公司);EDTA抗凝真空采血管(10 mL,山东省成武县华博医疗器械有限公司);彩虹180广谱蛋白marker(北京百瑞极生物科技有限公司);SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(武汉塞维尔生物科技有限公司);NewFlash Protein AnyKD PAGE蛋白电泳凝胶试剂盒(北京达科为生物技术有限公司);Anti-Human IgE (ε-chain specific)-Peroxidase antibody produced in goat(德国默克集团);Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate(德国默克集团);芒果过敏者血清(共7 例,来自问卷联络到的速发型芒果过敏者,相关过程已通过中国农业大学人体研究伦理委员会的审批)。
1.2 主要仪器与设备
冷冻干燥机(美国Labconco);电泳装置(北京市六一仪器厂);凝胶成像分析仪(上海勤翔科学仪器有限公司);Clinx Mini化学发光成像仪(上海勤翔科学仪器有限公司);nanoLC-Q EXACTIVE液相色谱-串联质谱仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司,由中科院生物物理研究所提供);C18反向色谱柱(150 mm×100 μm, 3 μm,由中科院生物物理研究所自组装)。
1.3 方法
下述所有方法使用的条件均已经过多次摸索。
1.3.1 芒果蛋白质粗提及浓度测定
参照张红云[7]等的酚抽提法并根据实验条件进行改进,提取芒果粗蛋白。将-80℃预冷的芒果去皮,用水果刀趁冷将冻实的果肉切成薄片,并立即投入4℃预冷的丙酮中进行脱脂,之后将其置于4℃冰箱中,3 h更换一次丙酮,直至上清液无色;弃上清,将脱脂后的果肉置于通风橱中,完全干燥后用研钵研成细粉,按重量比1:20加入提取缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCI, 0.7 mol/L蔗糖,50 mmol/L EDTA, 0.1 mol/L KCI, pH=7.0),4℃静置过夜。离心所得浆状物(4℃, 12000 r/min, 15 min),取上清液并以相同条件再次离心,以更多地沉淀果茸;弃沉淀,取上清,按体积比1:1.5加入Tris-饱和酚并震荡均匀,离心(4℃, 12000 r/min, 5 min)。抽取中间层酚并以相同条件再次离心,重复上述步骤3次,以得到较纯的酚相。按体积比1:2.5向酚相中加入乙酸铵/甲醇溶液(0.1 mol/L),震荡均匀,并于-20℃静置20 min后离心(4℃, 12000 r/min, 10 min);弃上清,将沉淀从壁上刮下并向其中加入20 mL丙酮,离心(4℃, 12000 r/min, 10 min);弃上清,将所得沉淀冷冻干燥后研成细粉,转移至离心管中于-80℃密封冻存。使用时加水复溶,并用BCA试剂盒及标准曲线法测定溶液浓度,稀释至所需浓度,得到待测样品。
1.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
采用不连续双垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分析芒果蛋白质粗提物的相对分子量组成。样品过0.22 μm滤膜后按体积比1:5加入5x上样缓冲液,沸水浴5 min,上样量25 μg。分离胶与浓缩胶浓度分别为12%和5%。初始电压80 V,溴酚蓝进入分离胶后改为120 V,移至距板下端1 cm时停止电泳。将凝胶取出并转移至带盖保鲜盒中,用考马斯亮蓝R-250染色液摇床染色30 min。除去染色液,加入脱色液并多次更换,直至凝胶上出现清晰的条带。用凝胶成像分析仪白光透射模式拍摄凝胶,得到SDS-PAGE图像。
1.3.3 免疫印迹(Western blotting)
为增加条带间分离程度,除将上样量改为15 μg、将分离胶浓度改为10%外,与上述SDS-PAGE相同。用湿转法将所得凝胶上的蛋白质转至PVDF膜上(200 mA, 103 V, 1.83 h),经清洗、封闭、清洗、一抗孵育(7 例单血清分别按体积比1:5稀释,4℃摇床过夜)、清洗、二抗孵育、清洗、显色、紫外模式拍摄等步骤,得到芒果潜在过敏原的免疫印迹图像。
需要说明的是,由于所用marker不能在紫外模式下显色,故文中展示的对照图由化学发光成像仪白光透射模式拍摄的marker和紫外模式拍摄的过敏原免疫印迹条带拼接而成,为保证二者的对应关系,拍摄过程中膜的位置保持不变。
1.3.4 液相色谱-串联质谱检测
电泳:为节省制胶时间、简化制胶流程,改用连续胶,根据说明书要求将电压调至300 V,并将上样量改为15 μg,除此之外与上述SDS-PAGE相同。
样品预处理:将所得电泳胶送至中科院生物物理研究所,人工切下4 个泳道的34 kDa处蛋白条带并捣碎混合,取其中的一半用于检测(含有样品30 μg),另一半备用。待测样品经脱色、干燥、烷基化、洗涤、干燥后,用80 ng改性胰蛋白酶/ 25 mmol/L NH4HCO3于37℃过夜酶解,最后加入1%的甲酸终止酶促反应,将所得溶液转移到样品瓶中。
色谱条件:选用C18反向色谱柱(150 mm×100 μm,3 μm)。流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液,流速300 nL/min,LC流动相梯度为:0~8 min,4%~8% B;8~58 min,8%~22% B;58~70 min,22%~32% B;70~73 min,32%~90% B;73~80 min,90%~90% B。
质谱条件:采用串联质谱,毛细管温度320℃,电喷雾电压2.0 kV,扫描范围300~1600(m/z),动态排除时间40 s,数据采集模式为1拖2(即一次完整的MS1扫描后接20 个最高丰度离子的二级谱图MS2分析)。
数据分析:检索软件为Thermo Proteome Discoverer(1.4.0.288),数据库为NCBI_Mangifera indica_2021。
1.3.5 热稳定性试验
参照《农业部2301 号公告-17-2013 转基因生物及其产品食用安全监测蛋白质热稳定性试验》的方法,并根据实验条件进行改进。电泳过程除使用连续胶、电压为300 V外,与上述SDS-PAGE相同。一抗是由7 例过敏者血清等比例混合而成的血清池,按体积比1:5稀释(“1”对应混合血清的总体积)。
1.3.6 生物信息学分析
过敏原数据来自allergen.org,芒果蛋白质的序列根据质谱结果中序列号在NCBI数据库中检索得到,序列比对工具采用NCBI的线上工具Protein BLAST,模式为blastp,并勾选align two or more sequences。
2 结果与分析
2.1 芒果潜在过敏原的初步确定
2.1.1 芒果蛋白质粗提物的分子量组成
由SDS-PAGE(图1)可知,芒果蛋白质粗提物中蛋白质的分子量组成为15 kDa、17 kDa、18 kDa、20 kDa、23 kDa、28 kDa、33 kDa、34 kDa、35 kDa、40 kDa、46 kDa、53 kDa、61 kDa、69 kDa、85 kDa、100 kDa。
2.1.2 芒果中潜在过敏原的分子量组成
由图2可知,芒果中潜在过敏原的分子量如表1所示。34 kDa亚基被5例芒果过敏者单血清结合,达到过敏原鉴定标准[6],故将其作为后续研究目标。图2中条带的分子量与图1不完全一致的原因可能是:对照marker进行分子量判定有误差;且因酶的催化具有高效性,Western blotting显色的灵敏度高于电泳染色,因此可能出现图1中不存在的条带。
注:M-marker;阴性-阴性对照;1~7-单血清编号
图2 芒果蛋白质粗提物免疫印迹图像
Fig.2 Image of Western blotting of mango protein crude extract
2.2 34 kDa目标蛋白质的质谱检测与生物信息学分析
2.2.1 34 kDa目标蛋白质的LC-MS/MS检测
经LC-MS/MS检测,34 kDa条带处电泳凝胶含有多种蛋白质,其酶解产物的LC-MS/MS基峰(Base peak)色谱图如图3所示。
表1 芒果中潜在过敏原分子量
Table 1 Molecular weight of potential mango allergens
血清编号 | 免疫印迹分子量 |
1 | 47 |
2 | 34、48、70、73、86、93 |
3 | - |
4 | 34、73 |
5 | 12、13、17、32、34、54 |
6 | 30、34、53、63、73、78 |
7 | 34、50、55 |
对于质谱结果中的蛋白质,根据参数Unique Peptides≥2筛选出29 种候选芒果蛋白质,之后按照Score从高到低排序得到可信度最高的7 种蛋白质,其信息如表2所示。因电泳与质谱所得分子量存在偏差,且标有partial的蛋白质在NCBI库中仅有部分序列及该片段对应的分子量被提供,故尚无法根据分子量确定其中何种蛋白质与目标蛋白质相对应,因此对上述7 种蛋白质进行生物信息学分析,以进一步筛选其中最有可能是芒果潜在过敏原的蛋白质。
2.2.2 质谱结果的生物信息学分析
将上述7 种芒果蛋白质与其他同芒果之间存在交叉反应的物种(包括香蕉[8]、芹菜[9]、艾蒿[9]和乳胶[10])的过敏原进行序列比对,筛选出与已知过敏原具有同源性的芒果蛋白质,它们更可能是芒果中的潜在过敏原[11],结果如表3所示。可见,在比对范围内,beta-1, 3-glucanase [Mangifera indica](ABD16200.1)和chitinase, partial [Mangifera indica](ACD69683.1)分别有3 次和2 次与已知过敏原同源;此外,前者与db.COMPAREdatabase.org中收录的6个beta-1, 3-glucanase, partial芒果过敏原片段序列高度重合,说明这6 个片段很有可能来自beta-1, 3-glucanase [Mangifera indica]。这两种蛋白质的分子量小于目标过敏原,推断其中的某种蛋白质可能是34 kDa蛋白质的一部分。
2.3 芒果过敏原的热稳定性
2.3.1 芒果蛋白质的热稳定性
由图4可知,共有12 条较为明显的芒果蛋白质条带,其热稳定性描述及结果判定如表4所示。可见34 kDa目标过敏原对热稳定,虽然不同芒果蛋白质的热稳定性有差异,但绝大多数芒果蛋白质对热稳定或较稳定,且其热稳定性的强弱随芒果蛋白质相对分子量的增大呈降低趋势。这可能是因为相对分子量较大的蛋白质普遍具有较为复杂的空间结构,因此更易受热而发生疏水基团的暴露,从而发生蛋白质变性聚沉,导致SDS-PAGE条带变浅[12]。相比之下,分子量较小的蛋白质的结构普遍较为简单,故加热对其结构和性质的影响较小,对其稳定性的影响也更小。
注:M-marker;0~60 min代表90℃水浴加热的时长
图4 芒果蛋白质的热稳定性试验(聚丙烯酰胺凝胶电泳)
Fig.4 Thermal stability test of mango proteins (SDS-PAGE)
2.3.2 芒果过敏原的热稳定性
在蛋白质热稳定性试验的基础上增设后续Western blotting试验,以探究热处理对芒果过敏原致敏性强弱的影响。由图5可知,共有5 条较为明显的芒果潜在过敏原免疫印迹条带,与图2中免疫印迹条带有明显不同,其原因可能是:前述Western blotting采用单血清,而本实验采用血清池,其中单种特异性抗体的浓度低于其在单血清中的浓度,故只有对于多例过敏者共同过敏的过敏原,血清池中才存在足够高浓度的特异性抗体与之结合,从而显出条带。芒果潜在过敏原的热稳定性描述如表5所示,由此可知,34 kDa目标过敏原的致敏性随热处理时间的延长无显著变化;所有过敏原的致敏性均未因90℃水浴60 min的处理而消失,且其强弱随热处理时间的延长呈现出不同且复杂的变化趋势。这可能是因为加热使过敏原的空间结构发生了改变:当隐藏的抗原决定簇被暴露时,致敏性升高;当暴露的抗原决定簇被破坏或隐藏时,致敏性降低[13];不同过敏原的结构不同,变化也不同。
注:M-marker;0~60 min代表90℃水浴加热的时间
图5 芒果潜在过敏原的热稳定性试验(免疫印迹)
Fig.5 Thermal stability test of potential mango allergens (Westem blotting)
表5 芒果潜在过敏原的致敏性随热处理时长的变化
Table 5 Sensitization variation of mango potential allergens with thermal treatment duration
芒果潜在过敏原相对分子量 (kDa) | 免疫印迹颜色随90℃水浴时长的变化 | |||||
0 min | 5 min | 10 min | 15 min | 30 min | 60 min | |
16 | 0 | 0 | ↑ | ↑ | ↑ | ↑ |
23 | ↓ | ↓ | ↓ | ↑ | ↑ | ↑ |
25~34 | (↓) | (↓) | (↓) | (↓) | (↓) | (↓) |
58 | ↑ | ↑ | ↓ | - | - | - |
67 | ↑ | - | ↓ | - | - | - |
注:0表示无明显印迹;↑/ - /↓表示在之后的时间段(5/15/30 min)内颜色加深/ 不变/ 变浅;(↓)表示在之后的时间段(5/15/30 min)内颜色略有变浅。 |
3 结语
本研究通过免疫印迹法初步确定了34 kDa蛋白质为芒果中的过敏原之一,并通过质谱检测和生物信息学分析推断beta-1, 3-glucanase与chitinase, partial为NCBI库中最有可能与之对应的蛋白质,为34 kDa芒果过敏原的鉴定提供基础;关于芒果蛋白质及潜在过敏原热稳定性的研究结果,描述了芒果蛋白质及潜在过敏原的性质,并对芒果热加工制品的致敏性评估有一定的指导意义。
然而,SDS-PAGE与LC-MS/MS在鉴定芒果过敏原方面存在一定的局限性,尚需进一步运用2D-PAGE和其他蛋白质鉴定方法,配合芒果蛋白质的分离提纯或重组表达以及血清学方法和动物实验,对34 kDa过敏原进行进一步的鉴定;并对纯化或重组表达后的芒果蛋白质进行模拟胃肠液消化试验,以进一步评价芒果蛋白质的致敏性。此外,可将34 kDa亚基所在条带质谱检测结果中的蛋白质与更多已知过敏原进行序列比对,以更准确地预测与34 kDa过敏原对应的蛋白质。
注:M-marker
图1 芒果蛋白质粗提物聚丙烯酰胺凝胶电泳图像
Fig.1 Image of SDS-PAGE of mango protein crude extract
Relative Abundance
图3 目标蛋白质酶解产物的LC-MS/MS基峰色谱图
Fig.3 LC-MS/MS base peak chromatogram of the targeted protein enzymatic hydrolysate product
表2 LC-MS/MS结果中可信度最高的7种蛋白质
Table 2 The top seven most credible proteins in LC-MS/MS result
Accession | Description | Score | Coverage | Proteins | Unique Peptides | Peptides | PSMs | AAs | MW (kDa) | calc. pI |
ADB43617.1 | alcohol dehydrogenase 2 [Mangifera indica] | 76.66 | 39.27 | 1 | 2 | 13 | 27 | 382 | 41.6 | 6.38 |
ACD69679.1 | 14-3-3, partial [Mangifera indica] | 70.75 | 73.18 | 2 | 16 | 19 | 29 | 261 | 29.3 | 4.78 |
ABD16200.1 | beta-1,3-glucanase [Mangifera indica] | 66.53 | 64.09 | 1 | 12 | 12 | 24 | 181 | 19.5 | 6.11 |
ACD69683.1 | chitinase, partial [Mangifera indica] | 63.60 | 53.33 | 1 | 12 | 12 | 27 | 240 | 25.5 | 6.15 |
CAA53078.1 | 3-ketoacyl-CoA thiolase B, partial [Mangifera indica] | 62.55 | 39.77 | 1 | 12 | 12 | 20 | 430 | 45.2 | 8.21 |
ADB43618.1 | alcohol dehydrogenase 3 [Mangifera indica] | 61.31 | 36.68 | 1 | 2 | 12 | 23 | 379 | 41.4 | 6.28 |
AEO45961.1 | actin 1 [Mangifera indica] | 58.56 | 49.60 | 27 | 1 | 14 | 21 | 377 | 41.6 | 5.49 |
表3 已知过敏原与7种芒果蛋白质的同源性比对
Table 3 Homology comparison between known allergens and seven mango proteins
物种名称 | 过敏原序列号 (NCBI) | 与该过敏原具有同源性的芒果蛋白质量 |
香蕉 (Banana) | CAC81811 | chitinase, partial [Mangifera indica](ACD69683.1) |
AAB82772 | beta-1,3-glucanase [Mangifera indica](ABD16200.1) | |
ADG36438 | ||
芹菜 (Celery) | 无 | |
艾蒿 (Mugwort) | ||
苦艾 (Wormwood) | ||
乳胶 (Latex) | AAA87456 | beta-1,3-glucanase [Mangifera indica](ABD16200.1) |
AAA33357 | chitinase, partial[Mangifera indica](ACD69683.1) | |
CAC42881 | ||
CAD24068 |
表4 芒果蛋白质的热稳定性
Table 4 Thermal stability of mango proteins
蛋白质相对分子量 (kDa) | 描述 | 热稳定性 |
18、20、23、26、34、42、50 | 处理60 min时,条带无明显减弱 | 对热很稳定 |
32、56、68 | 热处理60 min时,条带部分减弱或完全消失 | 对热较稳定 |
76 | 热处理5 min时,条带部分减弱 | |
101 | 热处理5 min时,条带完全消失 | 对热不稳定 |
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(文章类别:CPST-B)