刘 敏1 薛燕飞2 曹丙蕾1 张 群1

Research Progress on Bacillus Cereus Spores Detection

in Dairy Products

LIU Min1 XUE Yan-Fei2 CAO Bing-Lei1 ZHANG Qun1

Abstract With the rapid development of the dairy industry, premature spoilage of dairy products due to the contamination by

Bacillus cereus continues to cause a wide range of attention. Bacillus cereus is ubiquitously present in nature. There is a need to detect

and quantify spores directly in food samples, because Bacillus cereus might be present in food only in the sporulated form. This

paper discusses the advantages and disadvantages of traditional and newly-emerged microbiological methods including plate counting,

molecular biology, optical and biosensors methods in the detection Bacillus cereus spores in dairy products. The traditional methods are

time and labor consuming while the newly-emerged ones are highly sensitive and easy to operate but with low commercialization. The

application of technologies integrated with new identification elements, analysis techniques and materials are still to be promoted.

Keywords Bacillus cereus; spores; detection; dairy products

乳制品行业一直以来十分重视牛奶质量和食用安 7 ～ 10℃ 保存。乳制品制作需要应用各种加热工艺，

全，在乳制品进入加工工厂之前，一般将生奶冷却至 如巴氏杀菌、超高温（UHT）处理、干燥等。巴氏杀

基金项目：济南海关科研项目（2019JK004，2019JK007）

第一作者：刘敏（1984—），女，汉族，山东济南人，硕士，工程师，主要从事食品安全检测，E-mail: 1120liuliu@163.com

1. 济南海关技术中心 济南 250014

2. 青岛大港海关 青岛 266011

1. Technology Center of Jinan Customs district, Jinan 250014

2. Qingdao Dagang Customs, Qingdao 266011

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菌后奶的保质期主要由革兰氏阳性、杆状需氧菌 2 蜡样芽孢杆菌的孢子

的内生孢子决定，其中蜡样芽孢杆菌属孢子的影

响最为重要。嗜热内生孢子可抵抗巴氏杀菌过程， 为了抵抗环境压力，芽孢杆菌细胞采取的适应性

通过萌发生长来恢复活力，在巴氏杀菌奶中产生 策略是转化为孢子，由于它们是在母细胞内产生的，

腐败酶（蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶），从而导致 所以称为内生孢子 [10]。细菌从细胞分化为孢子的过

乳品异味 [1-2]。尽管 20 世纪以来，乳制品行业发展迅 程始于关键转录调节因子 Spo0A[11] 的磷酸化。饥饿

速，不断优化和改进加工工艺，但牛奶过早变质仍然 信号诱导 Spo0F 激酶的自磷酸化，然后是 Spo0B 激

是产业难题，由此导致的乳品召回事件给企业造成巨 酶和 Spo0A 的磷酸化 [12]。磷酸化的 Spo0A 可以修饰

大的环境和经济损失。 500 多个基因的表达，其中包括一些在孢子形成过程

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是一种产孢杆状 必不可少的调节因子 [13]。培养基的矿物成分可能对

动力学革兰氏阳性菌，耐高温、耐化学物质，能够在 孢子形成有显著影响，锰是芽孢杆菌属孢子形成的必

4 ～ 50℃ 温度范围内存活 [3]。蜡样芽孢杆菌分泌肠 需元素 [14]。热加工或包装乳制品中诱发蜡样芽孢杆

毒素、腹泻和呕吐毒素，可引起轻度或重度食物中毒， 菌孢子形成的风险因素包括高盐、缺氧、低温冷冻等

甚至会导致中枢神经系统中毒性休克综合征 [4-5]。蜡 环境压力。

样芽孢杆菌能在不利环境中以孢子的形式存活多年， 在孢子形成后，细菌可能会在没有营养的情况下

如饥饿、缺氧或干燥环境。孢子极易传播，可抵御高 休眠一段不确定的时间，但当条件变得有利时，它会

温、干燥、消毒剂、电离、辐射和紫外线等恶劣环境。 萌发并再次成为营养细胞。但某些食物处理方式，例

蜡样芽孢杆菌孢子广泛分布于土壤、空气、水、植物 如 65 ～ 80℃ 亚致死热暴露，可以作为萌发的触发因

和动物中，几乎存在于所有类别的食物中，如肉制品、 素 [15]。蜡样芽孢杆菌孢子在较低 pH 值（1 ～ 5.2）、

乳制品、蔬菜和大米等。孢子在经过巴氏消毒和其他 高温冲击（如 95℃，持续 2 min）或抗生素处理（如

热处理的乳制品中仍可存活，因此牛奶和各种乳制品 氨苄青霉素、头孢菌素和苯唑西林）等条件下具有很

极易被孢子污染。但超高温（UHT）处理可杀死牛奶 强的存活能力。

中的蜡样芽孢杆菌孢子 [6]，帮助乳品企业有效规避孢

子污染风险。本文中，我们总结了牛奶和乳制品中蜡 3 检测方法

样芽孢杆菌孢子的污染、来源和检测技术。

3.1 经典方法

1 乳品污染的来源 蜡样芽孢杆菌孢子或细胞的常规检测方法包括平

板计数法、商业免疫学试剂盒或液相色谱质谱联用仪

蜡样芽孢杆菌在自然界广泛分布，主要通过土壤 毒素检测法。国际上，计数和检测蜡样芽孢杆菌的官

和空气污染食物 [7-8]。蜡样芽孢杆菌孢子在土壤中含 方方法是 ISO 7932 和 ISO 21871。但这两种方法都没

量达 50 ～ 380000 CFU/g，空气中含量达＜ 100 CFU/ 有评估细菌产生毒素的能力，也没有从严格意义上将

m3。原料奶中的芽孢杆菌微生物种群组成表现出季节 蜡样芽孢杆菌与属内其他细菌区分开来，因此，结果

性差异，夏季蜡样芽孢杆菌孢子数量较高 [9]。土壤作 仅表达为“假定的蜡样芽孢杆菌”[16-17]。

为蜡样芽孢杆菌的主要孢子来源，奶牛在夏季放牧时 一般检测孢子的传统微生物学方法为在平板琼脂

更容易接触到孢子。冬季奶牛一般被圈养在室内，饲 上倾涂计数和显微镜观察计数。对于需氧菌的孢子检

料和垫料是主要的污染源。如果不严格执行挤奶卫生 测，如专门检测蜡样芽孢杆菌孢子的涂布技术，检测

标准，加工设备和运输过程中一旦受土壤、饲料和垫 流程：取样—热处理 75℃—平板涂布—计算—验证

料污染，则极易发生蜡样芽孢杆菌的孢子污染。 试验。需将均质样品溶液在 75℃ 下热处理 15 min，

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然后将 1 mL 溶液涂布到 MYP 培养基（甘露醇卵黄

取样 芯片上样 混合反应 观测结果

多粘菌素琼脂），通过溶血试验验证可疑菌落 [17]。

图2 LAMP-RnR-SlipChip法

梯度稀释热处理过的匀浆液，可评估孢子浓度。该方 Fig.2 Workflow by a LAMP-RnR-SlipChip method

法可定量乳制品中蜡样芽孢杆菌孢子的存活率，但需

要至少 2 d 的孵育才能获得结果。 3.3 吡啶二羧酸检测

3.2 PCR和LAMP 吡啶二羧酸是蜡样芽孢杆菌内生孢子独有的特异

芽孢杆菌属在致病性、菌落形态、生长动力学 性标志物，约占孢子总干重的 5% ～ 15%，加热或水

或孢子形成率方面具有高度的表征相似性，传统检 解孢子可释放吡啶二羧酸 [22]。通过测定吡啶二羧酸

测技术可能导致假阳性或假阴性，常用分子生物学 浓度，能够估算出可疑样品中的细菌孢子含量，用于

技术替代经典方法。孢子对化学或酶裂解具有高度 乳制品的快速筛查。目前有几种光学方法如分光光度

抗性，增加了 DNA 提取难度。目前市售的一些商业 法、表面增强拉曼光谱法（SERS）、红外光谱法，

试剂盒 [18]，可促使孢子萌发并从裂解的营养细胞中 已应用于吡啶二羧酸检测 [23-24]。其中，SERS 特别适

提取 DNA。 用于吡啶二羧酸检测，在强电磁场限制空间内，受表

使用编码参与溶血活性的磷脂酰胆碱特异性磷脂 面增强剂金银纳米团簇作用，单个或大量孢子可在几

酶基因作为靶标，开发了一种用于评估孢子浓度的实 秒钟内产生高度特异性的光谱特征。SERS 具有许多

时定量 PCR，对人工污染的婴儿配方奶粉中蜡样芽孢 优点，如灵敏度高、选择性强，无需额外生物标志物

杆菌的检测限每次反应约 4 个孢子或每毫升 60 个孢 提取以及不受水介质的干扰。此外，芽孢杆菌属的孢

子 [19]，见图 1。牛奶中孢子浓度过低，无法直接通过 子含量也可通过质谱法测定 [25]。利用吡啶二羧酸的

PCR 方法进行检测，因此在常规检测之前需要一个耗 特异性质荷比 m/z 167，直接对活菌样品中孢子浓度

时的微生物富集步骤。此外，牛奶含有高浓度的离子 进行定量，准确度良好。但是，以上基于拉曼光谱或

和脂肪，也会抑制 PCR 反应。为了克服孢子含量低、 质谱的检测方法常需要昂贵且复杂的仪器。

离子和脂肪浓度高的问题，Fisher 等 [20] 提出了一种 3.4 比色检测（横向流动）

基于适配体的磁性捕获方法。经过适配子修饰的二氧 横向流动测试利用试纸条提供色度信号，无需任

化硅磁珠能成功捕获来自不同脂肪含量牛奶的孢子， 何仪器即可肉眼评估结果。样品需在试纸条上横向迁

显示出高达 6 倍的富集效力，提高了后续 PCR 反应 移，因此对于复杂的食品基质，通常需要在分析前进

的检测限。 行样品预处理。该方法将超顺磁性分离与横向流动测

试相结合（图 3），可用于检测牛奶中的蜡样芽孢杆

磁性富集 孢子裂解 提取DNA PCR反应 验证试验

菌孢子 [26]。首先，用特异性抗体装饰的顺磁珠捕获

图1 PCR法 孢子，其次，将形成的免疫复合物滴加到横向流动测

Fig.1 Workflow by a PCR method

试的样品垫上。每个孢子又可与样品垫上的抗体表位

环介导等温扩增技术（LAMP）是另一种等温条 再结合，形成的免疫聚合物聚集成无法流过纸垫的大

件下快速即时的核酸扩增技术 [16]。LAMP 结合旋转 颗粒物，被沉淀在样品垫附近产生保留线。相反，无

反应滑动芯片（RnR-SlipChip）（图 2），可实现多 孢子的牛奶样品不形成保留线。

种细菌病原体的可视化同时检测，包括蜡样芽孢杆 3.5 生物传感器

菌 [21]。上样后，芯片旋转使目标细菌与芯片上的试 目前，能够靶向整个孢子的高效且特异性的识别

剂立即混合反应，60 min 内即可观测结果，成功率达 元件（如抗体、适配体）种类较少，因此仅有少数生

100%，该技术是否适用于检测蜡样芽孢杆菌的孢子 物传感器被报道。其中，电化学生物传感器的发展速

有待进一步研究。 度最快，具有成本低、灵敏度高且易于小型化的特

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适配体

孢子

抗体免疫结合孢子 磁性捕获 释放磁珠 测试条观察

孢子 磁珠 抗体

图3 免疫磁珠横向流动检测

Fig.3 Illustration of the immunomagnetic lateral flow sensor

点 [27]。2012 年，Bruno 和 Carrillo[28] 报道了一个适配

体序列，它能与蜡样芽孢杆菌的孢子特异性结合。基

于该适配体的结合特异性，开发出一种无需标记的阻

电信号变化

抗适配体传感器（图 4），检测线性范围为 104 CFU/

mL 至 5×106 CFU/mL，检出限为 3×103 CFU/mL。

图4 阻抗适配体电化学生物传感器

4 结论 Fig.4 Illustration of Electrochemical Signal Biosenser

measurement using aptasensor

本文总结了引起牛奶污染的蜡样芽孢杆菌孢子形

成过程和直接检测孢子的新型检测方法。目前用于乳 但已引起乳制品行业的广泛关注。公众对食品安全的

制品中孢子检测的传统平板方法耗时、耗力。新型分 需求将推动更多基于新识别元素、分析技术和新材料

析方法如 LAMP、电化学生物传感器和横向流动测试， 的组合技术出现，在实际应用中大规模推广，帮助食

具有灵敏度高、简易性强和低成本等优点，尽管针对 品生产商、零售商甚至消费者识别乳制品污染风险，

蜡样芽孢杆菌孢子检测的耗材只有少量商业化产品， 从而获得高质量的乳制品。

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（文章类别：CPST-B）

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第3卷 第12期

2021年12月

中国口岸科学技术