易在炯1 田桢干1 朱仁义2 王 强1 韩晓辉1 何宇平1*

Evaluation Methods and Influencing Factors of the

Chemical Disinfectants on Virus Inactivation

YI Zai-Jiong1 TIAN Zhen-Gan1 ZHU Ren-Yi2 WANG Qiang1 HAN Xiao-Hui1 HE Yu-Ping1*

Abstract As COVID-19 poses a serious threat to human health, the effective disinfection of potential contamination sites or

objects is paramount importance. It is a key step to evaluate the disinfection effect of chemical disinfectants on SARS-CoV-2. At

present, the classical method of disinfection effect evaluation is inactivation test of virus. This paper discussed this method in detail,

compared with the technical standards of EU and US, and analyzed their differences and similarities with China's standards. This paper

also analyzed the latest standards issued for COVID-19. At the same time, several key influencing factors were discussed in order to provide

reference for optimizing and establishing evaluation of the virucidal activity of chemical disinfectants for SARS-CoV-2.

Keywords chemical disinfection; virucidal activity; SARS-CoV-2

在新冠肺炎疫情防控中，环境卫生和消毒工作对 对化学消毒剂采取有效和准确的消毒效果评价，是保

于切断传播途径、保护易感人群发挥着重要作用。而 证消毒质量控制和消毒效果的前提。

基金项目：国家重点研发计划项目（2021YFC0863000）

第一作者：易在炯（1987—），男，汉族，浙江绍兴人，硕士，主治医师，主要从事消毒产品消毒效果评价，E-mail: 1348576804@qq.com

通讯作者：何宇平（1964—），男，汉族，江苏扬中人，本科，主任医师，主要从事公共卫生及消毒产品消毒效果评价，E-mail:

heyuping@customs.gov.cn

1. 上海国际旅行卫生保健中心（上海海关口岸门诊部）上海 200335

2. 上海市疾病预防控制中心 上海 200336

1. Shanghai International Travel Healthcare Center, Shanghai 200335

2. Shanghai Municipal Center for Disease Control and Prevention, Shanghai 200336

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CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY

目前，经典的化学消毒剂消毒效果评价方法是病 细规定。欧盟最新的悬液法病毒灭活试验标准版本

毒定量灭活试验。新冠肺炎疫情发生后，中国、美国 为 EN 14476:2013+A2:2019， 载 体 法 灭 活 试 验 标 准

及欧盟对消毒效果评价的技术标准进行了调整和更 根据不同应用场景，由不同标准作出规定，手卫生

新，主要在替代病毒、指示微生物选择等方面给出了 消毒由 prEN 17430 作出规定，物体表面消毒由 EN

相应的指导性意见。本文通过比较国内外化学消毒剂 16777:2019-01E 作出规定，自动化设备室内空气消

消毒效果评价方法的不同点，探讨在不同试验条件下 毒由 EN 17272:2020 作出规定，仪器设备消毒由 EN

如何建立和实施消毒效果评价方法，为进一步开展新 17111:2018-12E 作出规定。

冠病毒消毒效果评价及质量控制提供理论依据。 悬液法 EN 14476 又将病毒灭活试验分为 3 类，

分别是对包膜病毒有效的灭活试验、在有限范围内有

1 国内消毒效果评价方法 杀病毒效力的灭活试验、对所有病毒有效力的灭活试

验。第 1 类对包膜病毒有效的灭活试验仅需对痘苗病

病毒定量灭活试验 [1] 是指测定消毒因子作用前 毒进行试验；第 2 类在有限范围内有杀病毒效力的灭

后（或对照组与实验组）样本中病毒的量，观察消毒 活试验需对腺病毒及小鼠诺瓦克病毒进行试验；第 3

因子对病毒的灭活效果。病毒定量灭活试验的方法主 类对所有病毒有效力的灭活试验需对脊髓灰质炎病

要有细胞感染法、分子生物学法、动物感染试验及电 毒、腺病毒及小鼠诺瓦克病毒进行试验 [3]。针对新冠

镜技术，其中细胞感染法是评价消毒剂的首选方法 [2]。 病毒的灭活试验属于第 1 类，即可采用痘苗病毒作为

细胞感染法是以细胞病变作为判断指标，确定各组病 替代病毒开展悬液法消毒效果评价。这样的试验分类

毒的感染滴度，观察消毒因子对病毒的灭活效果。 有助于提高效率，同时对消毒产品进行分类，帮助人

我国《消毒技术规范》（2002 年版）将脊髓灰 们正确选择消毒方法，确定消毒剂的用量、浓度和接

质炎病毒 I 型疫苗株作为病毒代表株，进行消毒产品 触时间 [4]。

对病毒的灭活试验。主要步骤分为细胞准备、病毒悬 2.2 美国

液制备、载体制备、中和剂鉴定试验和病毒灭活试验。 美国的消毒效果评价标准主要由美国材料与试验

该方法可用于评价医疗器械、食具、物体表面和皮肤 协会（American Society for Testing and Materials , ASTM）

用化学消毒剂对病毒的灭活效果，可以对消毒因子的 制定。ASTM E1052-20（Standard Test Method for Efficacy

灭活病毒能力进行验证。 of Virucidal Agents Against Viruses in Suspension）是对悬

国家卫生健康委发布的 WS/T 775-2021《新型冠 液中病毒灭活效果进行检验，采用悬液法定量灭活病

状病毒消毒效果实验室评价标准》，首次对新型冠状 毒试验。该标准列出了对消毒剂有不同抵抗力的 10

病毒灭活试验作出具体规定。该标准规定试验病毒采 种病毒，如痘苗病毒（WR 株）、腺病毒等。用于

用新型冠状病毒培养物，细胞株可采用非洲绿猴肾传 灭活新冠病毒的消毒剂需要参照 ASTM E1052-20 进

代细胞（Vero-E6）或其他适合用于新型冠状病毒增 行 试 验。ASTM E1053-20（Assess Virucidal Activity

殖培养的细胞系 [1]。 of Chemicals Intended for Disinfection of Inanimate,

Nonporous Environmental Surfaces）对载体法定量灭

2 国外消毒效果评价方法 活病毒试验作出规定。

WS/T 775-2021、《消毒技术规范》（2002 年版）、

2.1 欧盟 欧盟 EN 14476 和美国 ASTM E1052-20 对病毒灭活试

欧 洲 标 准 化 委 员 会（European Committee for 验技术要点对比见表 1。通过比较发现，国内外消毒

Standardization, CEN）制定的 CEN/TC 216 法规及一 评价方法的主要步骤基本一致，但在指示微生物的选

系列标准对化学消毒剂的病毒定量灭活试验作出详 择、结果判定标准上有所差异。欧盟和美国标准对替

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中国口岸科学技术

代病毒进行了详细定义，并且针对不同研究对象罗列 验消毒剂溶液，与欧盟的标准趋于一致，并且考虑到

了相应的替代病毒，而我国标准中缺乏该部分内容。 了有机干扰物质的影响因素。

我国标准要求消毒后病毒载量下降 5 个对数值，结果 病毒所处环境对化学消毒剂灭活病毒的效果会产

判定要求比欧盟标准更为严格。 生较大影响，有研究表明载体上干燥的病毒比病毒悬

评价方法中化学消毒剂溶液量与试验病毒悬液量 液对化学消毒剂的抗力更强 [5]。因为在载体表面干燥

的比例对试验结果有重要影响，因此试验反应混合体系 的病毒会受到血液或唾液等有机物质保护，而对化学

对评价试验十分重要。针对新冠病毒消毒效果评价，我 消毒剂不敏感。因此，在试验中添加有机干扰物来模

国标准为 1 mL 干扰物质 +1 mL 试验病毒悬液 +8 mL 试 拟实际应用场景中病毒所处环境十分必要。

表1 国内外病毒灭活试验技术标准中技术要点的比较

Table 1 Comparison of technical points of standards for virucidal activity

范围 材料和试剂

技术标准

消毒剂适用范围 干扰物质 试验病毒种类 试验病毒浓度 消毒剂配制 消毒剂浓度设置

医疗器械、食具、 分装保存并确定病 分装保存并确定病

稀释至所需浓度的

WS/T 775-2021 物体表面和皮肤用 牛血清白蛋白 毒滴度的新型冠状 毒滴度的新型冠状 使用浓度

1.25倍

化学消毒剂 病毒培养物 病毒培养物

医疗器械、食具、 脊髓灰质炎病毒 Ⅰ 取病毒悬液按病毒 不少于1个浓度，3

《消毒技术规范》 稀释至所需浓度的

物体表面和皮肤用 牛血清白蛋白 型（Poliovirus-Ⅰ， 滴度测定法测定其 个作用时间（不短

（2002年版） 1.25倍

化学消毒剂 PV-Ⅰ）疫苗株 病毒滴度 于30 s）

仪器设备、手和表 牛血清白蛋白和 痘苗病毒（MVA 不低于108 TCID50 / 配制浓度应为使用 2个使用浓度和1个EN 14476

面的消毒剂 红细胞 株或Elstree株）等 mL 浓度的1.25倍 无效浓度

痘 苗 病 毒 （ W R 病 毒 滴 度 不 低 于

ASTM E1052-20 灭活病毒的消毒剂 无 使用浓度 使用浓度

株）、腺病毒等 104，不高于106

试验方法 结果计算

技术标准 残留消毒剂活性 病毒滴度的测定

试验温度 反应混合物体系 计算方法a 试验消毒剂合格判定标准

去除方法 方法

1 mL干扰物质＋1 mL

logN －logN ≥ 5（悬

WS/T 775-2021 (20±1)℃ 试验病毒悬液＋8 mL 中和剂法 终点稀释法 logN － logN 0 x0 x 液法）

试验消毒剂溶液

0.1 mL干扰物质＋0.1 logN －logN ≥ 4；阳

《消毒技术规范》 中和剂法和物理稀 终点稀释法和 0 x

(20±1)℃ mL 试验病毒悬液＋0.8 logN － logN 性对照组病毒滴度对数

（2002年版） 释法 噬斑法 0 x

mL 试验消毒剂溶液 值应在5～7 之间

1 mL干扰物质＋1 mL

物理稀释法和凝胶 终点稀释法和

EN 14476 (20±1)℃ 试验病毒悬液＋8 mL logN0－ logN logN过滤法 噬斑法 x 0

－logNx ≥ 4

试验消毒剂溶液

1 mL试验病毒悬液＋9 中和剂法和物理稀

ASTM E1052-20 (22±2)℃ 终点稀释法 logN0－ logN 未提及

b

mL试验消毒剂溶液 释法 x

注：a 中 N0 代表未经消毒剂处理的阳性病毒对照的滴度值，Nx 代表消毒剂处理的病毒滴度值；b 表示 ASTM 协会在不同类型消毒剂产品标准

中规定了相应的判定标准。

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CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY

3 影响消毒效果评价的因素 E1052 标准评价了一款口腔喷雾剂对新冠病毒的灭活

效果，其将制作的新冠病毒悬液加入消毒剂中，作用

为取得准确的消毒效果评价结果，需要关注消毒 20 min 后接种宿主细胞并观察结果，结果显示该喷雾

效果评价试验步骤中的每一个细节，评价方法中一个 对新冠病毒体外试验的灭活率为 98.3%。而载体法是

细小的差别可能会导致评价结果的巨大差异。本文对 将病毒悬液滴染于不同材料的载体上，再经消毒液作

消毒效果评价方法中的重要影响因素进行了讨论。 用。Miyaoka 等 [14] 运用载体法病毒灭活试验评价多种

3.1 替代病毒的选择 消毒剂对新冠病毒的消毒效果，其将禽传染性支气管

由于新冠病毒致病性强和危害性大，还存在体外 炎病毒（IBV）染于塑料载体上，再将消毒液滴于载

增殖困难的问题，试验操作难度极大。当实验室条件 体上，使两者作用 1 min 后接种宿主细胞并观察结果。

无法满足所需测试消毒剂对新冠病毒的灭活试验时， 同一种消毒剂在分别使用悬液法和载体法进行消

可采用替代病毒代替新冠病毒进行试验。替代病毒应 毒效果评价时会得到不同的评价结果。存活于菌悬液

具备安全性高、稳定性好、可操作性强和易增殖等特 中的病毒比存活在物体表面的病毒更容易被灭活，因

点 [6]。这类病毒应与新冠病毒结构和属性类似，对人 此，载体法所得消毒剂灭活病毒的浓度更高，作用时

体致病性较弱且易于体外增殖。王立钦等 [7] 采用冠 间更长。奚兵等 [15] 分别采用悬液法和载体法测定了

状病毒 GX_P2V 毒株（分离于穿山甲）作为替代病 醋酸氯己定对金黄色葡萄球菌的灭活效果，发现在取

毒，其与新冠病毒基因序列同源性为 86%，S 蛋白氨 得同样消毒效果的情况下，悬液法比载体法需要的时

基酸序列同源性为 92%，且可在 P2 实验室培养及操 间更短。这种差异提示用载体法评价消毒产品的消毒

作。Steinmann[8] 用 牛 冠 状 病 毒（Bovine coronavirus, 效果比悬液法更严格。林秋婵等 [16] 在评价柠檬酸消

BCV） 或 禽 传 染 性 支 气 管 炎 病 毒（Avian infectious 毒液的杀菌效果时发现，悬液法可能由于不同人的操

bronchitis virus, IBV）代替新冠病毒开展化学消毒剂 作（不同的振摇试管力度）得出不同的评价结果，而

对新冠病毒的灭活实验。欧盟 EN 14476 规定，改良 载体法则只与所选择的载体有关。

型痘苗病毒安卡拉株（Modified vaccinia virus Ankara, 载体法将指示微生物染于特定载体上并干燥，且

MVA） 或 痘 苗 病 毒 Elstree 株（Vaccinia virus strain 载体可以是塑料、金属和玻璃等材质。因此，载体法

Elstree）可作为包膜病毒的替代病毒进行病毒灭活试 比悬液法更能模拟出消毒剂实际使用条件下的情况，

验 [9]。有体外试验比较了碘消毒剂对痘苗病毒、埃博 真实反映出消毒剂的消毒效果 [3]。在新冠病毒消毒效

拉病毒、SARS 病毒和 MERS 病毒的灭活效果，结果 果评价中，建议首选载体法。使用载体法时，一般选

显示痘苗病毒是抵抗力最强的病毒，适合作为替代病 择布片作为载体；使用气雾或超低容量喷雾等消毒方

毒 [10-11]。 式时，则不可使用布片和滤纸片等有吸附能力的载体，

运用载体法时，需要选择合适的替代病毒，某些 可选择金属片或玻璃片 [17]。

病毒在干燥过程中，载体上存活的病毒会大量减少， 3.3 残留消毒剂的去除方法

如脊髓灰质炎病毒在干燥过程中会损失 3-log10 的病 在化学消毒剂消毒效果评价试验中，有效去除接

毒载量 [12]。这类病毒不适合作为载体法的替代病毒。 种标本中残留消毒剂对试验微生物的持续抑杀作用，

在运用载体法评价包膜病毒时，MVA 病毒是首选的 是准确评价消毒剂灭活作用的关键环节 [18]。在评价

替代病毒 [3]。 消毒剂对新冠病毒或其替代病毒的灭活效果时，必须

3.2 试验方法的选择 要在试验设计的作用时间内立即终止消毒剂的作用，

病毒定量灭活试验可分为悬液法和载体法。悬液 才能准确检测试验体系中存活病毒的量，并保证其正

法是将病毒悬液加入消毒液，作用规定时间后接种宿 常的生长繁殖，从而得到准确结果 [18]。常见去除残

主细胞检测病毒滴度。Agùsta 等 [13] 参照美国 ASTM 留消毒剂的方法有化学中和法、过滤冲洗法和稀释法

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中国口岸科学技术

等 [19]。化学中和法的特点是操作简单、效果可靠， 在开展实验室试验前，消毒剂要达到相应低温后

是目前消毒效果评价中最常用的方法 [20]。稀释法多 方可进行试验，染菌载体干燥后在低温下至少放置

用于浓度系数较高的消毒剂（如醇类消毒剂），常与 30 min，操作过程中要确保低温消毒剂和菌片的作用

其他方法同时使用 [18]。稀释法会因为稀释过多导致 温度保持在相应低温条件 [17]。同时，增加消毒剂低

病毒浓度下降，可能出现假阴性结果 [21]，因此，需 温试验，即在低温消毒剂说明书规定的最低适用温度

要注意在最低稀释度条件下确保能准确检出存活的病 下，测试该消毒剂是否能保持液体状态。

毒。过滤冲洗法多用于难以找到适宜中和剂的杀菌试

验中，如以植物提取物制备的消毒剂和难以中和的复 4 结语

合季铵盐类 [18]。过滤冲洗法常与稀释法、化学中和

法同时使用。陈茂义等 [22] 在新冠病毒灭活试验中， 我国的化学消毒剂病毒灭活试验方法及主要步

采用将消毒剂和中和剂同步稀释的方法，当含氯消毒 骤与欧盟及美国标准相近。欧盟和美国的相关标准

剂稀释到 750 mg/L，1% 硫代硫酸钠作为中和剂稀释 中都对替代病毒作出相应规定，而我国标准中缺少

到 0.375% 时，中和剂鉴定试验效果最佳。 替代病毒的相关定义，建议开展这方面的基础研究

试验方法、消毒剂配方及指示微生物的不同，会 并加以补充。

使同一种中和剂产生不同的中和效果 [23]。因此，在 对消毒产品消毒效果评价时，建议首选载体法评

试验设计中选择合适的中和剂或去除方法后，仍需要 价，相比悬液法可以得到更准确的评价结果。试验中

进行中和效果验证试验，最终确定所选择的中和剂或 对于残留消毒剂的去除，可同时采用中和剂法和物理

去除方法满足实验要求。 稀释法，并开展残留消毒剂验证试验，从而最大限度

3.4 低温环境对消毒效果的影响 地降低残留消毒剂对评价结果的影响。在评价低温消

我国东北地区冬季气温较低，常在 -20 ～ -30℃ 毒产品消毒效果时，要注意在整个试验过程中应始终

之间，对新冠病毒室外场所消毒面临着消毒液结冰 保持相应的低温条件。

和消毒剂效力减弱等实际问题 [24]。Shahid 等 [25] 与 建立一套准确高效的消毒评价方法十分重要，能

Wanaratana 等 [26] 研究发现，温度是影响化学消毒剂 完成终末消毒效果评价，及时准确评估所采取的消毒

功效最重要的因素之一。因此，在低温环境下准确评 措施是否达到要求，确保消毒场所或对象清除病毒，

估对新冠病毒消毒效果显得尤为重要。在实际工作中， 防止病毒传播。同时，准确的消毒评价方法有助于科

要注意低温对消毒效果评价的影响，及时改进方法， 学消毒、精准消毒，避免过度消毒，减少对环境的污

将低温对评价试验产生的影响降至最低。 染和引发人体健康问题。

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（文章类别：CPST-C）

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第3卷 第12期

2021年12月

中国口岸科学技术

Analysis and Evaluation / 分析评估