谢少冬1 王 园1 范春蕾1 贾江刚1 钱 宁1 湛 嘉2* 曹国洲2 陈先锋2

A Rapid Analysis of Polypeptide Antibiotics in Livestock

and Poultry Meat by Liquid Chromatography Tandem

Mass Spectrometry

XIE Shao-Dong1 WANG Yuan1 FAN Chun-Lei1 JIA Jiang-Gang1

QIAN Ning1 ZHAN Jia2* CAO Guo-Zhou2 CHEN Xian-Feng2

Abstract A rapid and simple analytical method was developed to identify 3 polypeptide antibiotics in chicken and beef. The

meat was extracted and purified by the EDTA-ammonium formate-methanol precipitator and n-hexane, and the underlying extract

was concentrated and filtered before analysis by LC-MS/MS in positive ion mode without purification by SPE. The results showed

that the optimized pretreatment method could fully remove the interference of complex matrix with good specificity and sensitivity.

The limit of quantitation (LODs) and the limit of quantification (LOQs) varied from 5 to 10 µg/kg and 10 to 25 µg/kg, respectively.

The linearity of matrix-matched addition curves was more than 0.9950. The average recovery of the spiked polypeptides in chicken

基金项目：宁波市创新团队重点专项（2015C110018）

第一作者：谢少冬（1994—），男，浙江宁波人，本科，助理工程师，主要从事食品安全检测，E-mail: 510475413@qq.com

通讯作者：湛嘉（1977—），男，湖南平江人，博士，研究员，主要从事食品、化妆品安全检测与研究，E-mail: zhanjia2000@163.com

1. 宁波中盛产品检测有限公司 宁波 315012

2. 宁波检验检疫科学技术研究院 宁波 315012

1. Ningbo Zhongsheng Product Testing Co., Ltd., Ningbo 315012

2. Ningbo Institute of Inspection and Quarantine Science and Technology, Ningbo 315012

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CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY

was in the range from 86.9% to 120.2% with associated RSD values from 1.2% to 6.0%. The inter-day precision was in range of 3.3%

to 5.5%, the average recovery of the spiked polypeptides in beef was in the range from 89.3% to 114.0% with associated RSD values

from 0.6% to 6.0%, and the inter-day precision was in range of 1.9% to 7.3%.

Keywords polypeptide antibiotic; ion-pairing agent; sample preparation

多肽类药物是一类具有多肽结构特征、能在生物 公司。水由 Milli-Q 纯水仪（Millipore）纯化得到，

体内经诱导产生生物活性的抗生素 [1-4]。它们对革兰 其他试剂为国产分析纯。

氏阳性菌有强烈的抑制作用，在肠道内肽类抗生素几 1.2 前处理

乎不被吸收，仅在消化道内发挥作用，动物采食后在 称取粉碎后的牛肉或鸡肉样品 5 g（精确到 0.01 g）

体内不仅一般无残留，而且在饲料中长期添加肽类抗 置于 50 mL 刻度离心管中，加入 20 mL EDTA- 甲酸铵 -

生素，致病菌不易产生耐药性，使用效果稳定 [1]。因 甲醇组合沉淀剂和 10 mL 正己烷，以 20000 转 /min

此，多肽类药物被广泛用作兽药添加到动物饲料中， 匀浆 3 min，涡旋混合 10 min。在 0℃ 下，以 4500 r/

用于预防治疗动物疾病，促进饲料转化率和提高动 min 离心 10 min，取约 4 mL 下层清液通过致密的脱

物生长速度 [1-11]。与此同时，多肽类也含有一定的肾 脂棉过滤到另一只 15 mL 离心管中，直至 3.0 mL 刻

脏毒性和神经毒性，长期过度添加或滥用会导致动物 度线，在 40℃ 水浴中氮吹至 1.5 mL 刻度线以下，用

体内或产品药物残留，从而引发食品品质甚至食品安 50% 甲醇定容至 1.5 mL 刻度线，混匀后在 0℃ 下，

全问题 [2-4]。因此，加强动物源性食品中的多肽类抗 以 13000 r/min 离心 10 min，经孔径为 0.2 μm 的尼龙

生素监测非常必要。从目前已有为数不多的文献报道 滤膜过滤至 1.5 mL 进样瓶中，供 UPLC-MS/MS 测定。

和标准检测方法来看，几乎都采用了液质联用法 [2-13]。 1.3 UPLC-MS/MS 分析

这些方法中普遍存在针对性不强的现象，忽略了多肽 流动相 A 和 B 分别为：甲醇〔含甲酸 0.1% (v/v)〕

类抗生素的理化性质特殊性，带来样品沉淀净化效果 和水〔含三氟乙酸和甲酸各 0.1% (v/v)〕；进样量：

欠缺、峰拖尾现象导致检测灵敏度低下以及前处理效 10 μL；通过流路切换，使得 5 ～ 12 min 期间进行质

率不高等问题。因此，开发针对性强、高效快捷、灵 谱采集，其余时段的色谱柱流出液进入废液。其他仪

敏可靠的多肽类抗生素检测方法具有一定的迫切性。 器条件参照文献 [14]。

1.4 方法验证

1 实验部分 在 5.00 g 空白样品中分别加入混合标准溶液 0

μL、20 μL、50 μL、100 μL、250 μL、500 μL、1000

1.1 化学品和试剂 μL，用来制作基质添加标准曲线。

3 种多肽类抗生素标准物质购自 Sigma 公司，用 对 15 个不同的空白样品进行前处理并分析，考察

二甲亚砜溶解，并用甲醇配制成 0.5 mg/mL。用移液 潜在的干扰峰。在 5.00 g 空白样品中，加入混合标准

器吸取各单标适量，用甲醇稀释成多粘菌素 A、多粘 工作液 0 μL、10 μL、20 μL、50 μL、100 μL，分别

菌素 B 和杆菌肽 A 分别为 500 ng/mL、1000 ng/mL、 以信号大于 3 倍和 10 倍信噪比作为定性和定量检测

2000 ng/mL 的混合标准工作溶液，-18℃ 保存。甲醇、 限。在 5.00 g 空白样品中加入混合标准溶液 50 μL、

三氟乙酸、乙酸铵和正己烷等试剂为 HPLC 级别，由 100 μL 和 500 μL，测定 3 个添加水平的回收率及其

美国天地公司提供。EDTA- 甲酸铵 - 甲醇组合沉淀剂 变异系数（n=6）。连续 6 天，在 5.00 g 样品中添加

（Supertech EFM-P, cat.#55251-6）购自浙江哈迈科技 100 μL 混合标准工作液，计算其批间精密度（n=6）。

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中国口岸科学技术

2 结果与讨论 固相萃取净化，如 HLB、Strata-X 和 C [6,10-11]18 。然而，

固相萃取步骤相对比较繁琐，不利于提升样品的通量。

2.1 前处理方法的优化 本方法采用的双相提取法，使提取和主要净化步骤一

从当前文献报道来看，提取动物源性食品和饲料 步完成，极大提高了前处理效率。

中多肽类抗生素药物的常见溶剂包括高氯酸溶液 [4]、 2.2 色谱条件和质谱条件的优化

甲醇 - 水 - 甲酸 (40:60:0.1 或 50:50:0.1, v/v/v) [3,5-6]、80% 首先，我们对流动相的组成进行筛选。在流动相

乙腈等 [7]。也有学者采用甲醇 - 水 - 甲酸 (40:60:0.1, 水 - 甲醇体系中，当选择乙酸铵作为流动相添加剂（浓

v/v/v) 混合溶剂提取后，再用三氯乙酸和乙腈溶液沉 度 2.5 mmol/L）时，3 种目标化合物均未见色谱峰的

淀蛋白 [2,8-9]。为了获得更好蛋白沉淀效果和提取效率， 出现。在流动相中添加 0.1% 甲酸后，可以观察到拖

我们对比了不含有机溶剂的 5% 三氯乙酸、甲醇 - 水 - 尾严重的色谱峰，色谱峰宽达到 1 min 以上，灵敏度差。

甲酸 (40:60:0.1, v/v/v)、市售的 EDTA- 甲酸铵 - 甲醇 而当在添加 0.1% 甲酸的基础上，再添加 0.1% 三氟乙

组合沉淀剂等 3 组提取溶剂，并与不互溶的正己烷一 酸后，不仅保留时间增加，色谱峰宽度显著变窄，灵

起，通过匀浆机充分匀浆提取和净化。结果表明：组 敏度显著提升，如图 1 所示。因此，最终流动相选择

合沉淀剂蛋白沉淀效果最佳，溶液完全呈透明澄清状。 添加水（0.1% 三氟乙酸 +0.1% 甲酸）- 甲醇（0.1% 甲酸）

甲醇 - 水 - 甲酸 (40:60:0.1, v/v/v) 的沉淀效果次之，5% 体系。从文献报道和标准方法来看，除 Kaufmann 等 [5]

三氯乙酸的沉淀效果最差。从提取效率来看，EDTA- 的色谱条件较为接近外，多数方法并未采用离子对

甲酸铵 - 甲醇组合沉淀剂和 40% 甲醇溶液的 3 种目 试剂。

标物的回收率均大于 90%，而 5% 三氯乙酸提取杆菌 其二，流动相的梯度对杆菌肽 A 的检测灵敏度

肽 A 的相对回收率仅为 68.1%，这主要由于净化效 和信噪比影响显著。如图 2 所示，当采用梯度洗脱程

果差带来强的基质效应所致。因此，我们最终选择了 序 1 时，杆菌肽的保留时间为 6.77 min，其附近存在

EDTA- 甲酸铵 - 甲醇组合沉淀剂。 大量的干扰峰，当添加量低于 25 μg/kg 时，几乎很

除了正己烷去脂净化外，多数方法仍需采用反相 难辨别出目标峰的存在，基质效应影响显著。当采

a. 添加0.1%甲酸；b. 添加0.1%三氟乙酸和0.1%甲酸

图1 不同流动相条件下牛肉中多肽类抗生素的色谱图

Fig.1 Chromatogram of 3 polypeptide antibiotics in beef with different mobile phase additives

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CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY

用相对缓和的梯度洗脱程序 2 时，目标峰保留时间在 2.3 方法的有效性

11.06 min，与干扰峰分离度良好，从而削弱了基质效 2.3.1 选择性、线性和定量检测限

应的影响，灵敏度显著提高，见图 2。 根据 15 个空白鸡肉和 15 个牛肉样品的分析发

另外，多肽类抗生素的电喷雾 ESI 信号普遍存在 现，本方法能为 3 种多肽类药物提供低背景且无明显

两价态和三价态两种母离子。Wan 等 [10] 采用二价态 干扰的质谱图，选择性好，见图 1b。在线性范围内

的定性和定量离子进行监测，而刘佳佳等 [2] 则采用 相关系数 R 在 0.9976 ～ 0.9996。定性检测限为 5 ～ 10

多离子检测模式（MRM）对两种价态的定性和定量 μg/kg，定量检测限为 10 ～ 25 μg/kg，低于日本规定

离子进行监测。我们也对比了两种价态的母离子对灵 最大残留限量 30 μg/kg，详见表 1。

敏度的影响，发现两价态的响应强度更大。因此，选 2.3.2 准确性和重复性

用两价态的电离方式，见表 1。 鸡 肉 中 3 个 水 平 的 平 均 添 加 回 收 率 在

c. 梯度洗脱1（0～8 min，从100%水相过渡到100%有机相），对应的保留时间为6.77 min；

d. 梯度洗脱2（0～15 min，从100%水相过渡到100%有机相），对应的保留时间为11.06 min

图2 不同洗脱条件下牛肉中的添加50 μg/kg杆菌肽A的色谱图

Fig.2 Chromatogram of beef with 50 μg/kg bacitracin A under different elution conditions

表1 3种多肽类抗生素的保留时间、特征离子对、锥孔电压、碰撞电压和检测限

Table 1 Retention time, characteristic ion, cone voltage, collision voltage and detection limit of the 3 polypeptide antibiotics

保留时间 锥空电压 定量离子对 定性检测限 定量检测限

化合物 标准曲线、线性及线性范围

(min) (V) (碰撞电压, V) (μg/kg) (μg/kg)

y＝1259.1x－178.5; 0.9976 (鸡肉)

585.6 >101.1*(30)

多粘菌素A 10.46 38 y＝1261.6x－129.4; 0.9982 (牛肉) 5 10

585.6 >241.2(30)

0.5～50 ng/mL

y＝1261.1x－525.1; 0.9975 (鸡肉)

578.6 >101.1*(35)

多粘菌素B 10.02 40 y＝1257.4x－218.8; 0.9996 (牛肉) 5 10

578.6 > 227.2(35)

0.5～50 ng/mL

y＝179.5x＋114.8; 0.9995 (鸡肉)

712.2>110.1*(62)

杆菌肽A 11.06 36 y＝181.7x－152.3; 0.9989 (牛肉) 10 25

712.2>199.2(52)

1.0～100 ng/mL

注：* 为定量离子对

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中国口岸科学技术

86.9% ～ 120.2%。添加回收重复性和再现性范围分别 日内和日间精密度数据见表 2 和表 3。

为 1.2% ～ 6.0% 和 3.3% ～ 5.5%。牛肉中 3 个水平的 2.4 实际应用

平均添加回收率在 89.3% ～ 114.0%。添加回收重复 该方法被成功应用于抽检的鸡肉和牛肉各 30 份

性和再现性范围分别为 0.6% ～ 6.0% 和 1.9% ～ 7.3%。 样品，均为阴性，抽查的肉类产品的相关安全风险

两种基质的 RSD 均低于 10%。详细的平均回收率、 较小。

表2 鸡肉中3种多肽类抗生素添加回收率及其变异系数、日间精密度（n=6）

Table 2 The average recovery, repeatability and inter-day precision of 3 polypeptide antibiotics in chicken (n=6)

添加回收率 (%) 平均回收率 重复性 R再现性

化合物名称 添加水平

1 2 3 4 5 6 (%) (%) (%)

L 86.5 87.8 93.9 89.6 88.8 89.2 92.8 5.2 -

多粘菌素A M 93.7 86.2 89.0 92.8 99.7 95.2 89.3 2.8 3.3

H 102.7 100.5 99.7 104.2 102.9 102.8 102.1 1.6 -

L 92.3 91.1 95.8 92.8 91.7 96.2 86.9 4.1 -

多粘菌素B M 83.9 90.9 86.0 82.9 91.9 85.9 93.3 2.3 3.9

H 97.9 95.7 96.9 97.8 95.1 96.8 96.7 1.2 -

L 109.4 114.9 101.1 108.1 113.9 99.1 107.8 6.0 -

杆菌肽A M 117.6 116.2 125.1 118.8 118.8 124.5 120.2 3.1 5.5

H 95.1 87.1 95.6 94.1 86.1 97.6 92.6 5.2 -

注：L、M 和 H 分别代表低、中、高 3 个水平

表3 牛肉中3种多肽类抗生素添加回收率及其变异系数、日间精密度（n=6）

Table 3 The average recovery, repeatability and inter-day precision of 3 polypeptide antibiotics in beef (n=6)

添加回收率 (%) 平均回收率 重复性 R再现性

化合物名称 添加水平

1 2 3 4 5 6 (%) (%) (%)

L 92.8 101.1 95.1 92.4 99.5 95.1 96.0 3.7 -

多粘菌素A M 102.9 101.9 103.9 103.7 104.0 102.4 103.2 1.8 1.9

H 88.6 89.9 88.9 89.9 88.9 89.6 89.3 0.6 -

L 97.8 93.3 91.9 97.3 93.6 92.7 94.5 2.6 -

多粘菌素B M 92.8 92.1 91.6 96.4 91.1 92.6 92.8 2.0 4.1

H 99.6 102.1 97.7 99.7 101.6 98.1 99.8 1.8 -

L 104.9 121.1 111.8 105.6 119.7 113.8 112.8 6.0 -

杆菌肽A M 121.1 113.2 108.5 119.1 112.2 110.1 114.0 4.4 7.3

H 97.9 93.1 91.9 99.9 91.1 86.8 93.5 5.1 -

注：L、M 和 H 分别代表低、中、高 3 个水平

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CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY

3 结论 固相萃取净化。结合离子对试剂的应用，具有特异

性强、灵敏度高，准确性和重复性理想等特点，可

检测畜禽肉中的 3 种多肽类抗生素，通过快速简 满足高通量的畜禽肉中相关药物的快速简便筛查与

便的双相提取净化能有效去除复杂基质干扰，无须 确证的需要。

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（文章类别：CPST-B）

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第3卷 第12期

2021年12月

中国口岸科学技术

Analysis and Evaluation / 分析评估