段效辉1 杨 柏1 李金庆1 徐 娟1 曲志勇1

关键词 贾第鞭毛虫；隐孢子虫；分子生物学技术；检测

Application of Modern Molecular Biology Techniques in

Detecting Giardia spp. and Cryptosporidium spp.

DUAN Xiao-Hui1 YANG Bai1 LI Jin-Qing1 XU Juan1 QU Zhi-Yong1

Abstract With the development of molecular biology techniques, the application of fluorescence in situ hybridization,

polymerase chain reaction, loop mediated isothermal amplification and other methods in the detection of Giardia spp. and

Cryptosporidium spp. in water has been developed rapidly, which not only improves the detection sensitivity and accuracy, but also

greatly improves the diversity of detection methods and the convenience of detection operation. This paper reviewed the application

of the molecular biological detection techniques of Giardia spp. and Cryptosporidium spp. in recent years and looked into their

prospect in the future.

Keywords Giardia spp.; Cryptosporidium spp.; molecular biology techniques; detection

贾第鞭毛虫（Giardia spp.）和隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）（以下简称“两虫”），是2种致病性原生动物寄生虫。作为最常见的肠道原生动物寄生虫，“两虫”可引起胃肠道疾病，还会导致营养失衡和严重的健康问题[1]，尤其会对免疫力低下的人群健康构成重大威胁[2]。水作为“两虫”主要的传播介质，其安全性受到严重威胁。近年来，随着国内外对水质安全要求不断提高，水中“两虫”的检测研究也日益受到重视。

水中“两虫”的检测和鉴定对监测、预防和控制“两虫”具有重要意义。目前，用于两虫检测的技术手段主要有传统显微观察、免疫学技术、流式细胞仪法以及分子生物学技术（表1）。我国现行检测水中“两虫”的有效国家标准[9-10]是以染色和显微观察为主要技术手段，不但存在费时费力、特异性不强的缺点，且回收率在10%～100%之间，误差较大。基于免疫学技术手段也存在特异性不强、操作复杂等缺点，这几种技术在实际应用中都存在一定的局限性，见表1。现阶段，以遗传特征为基础的分子生物学技术，如荧光原位杂交、聚合酶链式反应等方法具有高通量、高精密度以及高准确度等优势，在“两虫”检测应用研究中取得重大进展，并展现出越来越大的潜力。本文综述了现阶段基于分子生物学的先进检测技术在水中“两虫”检测中的应用。

1 荧光原位杂交

荧光原位杂交（FISH）是将荧光标记的寡核苷酸或探针杂交到目标生物体DNA或RNA的特定区域。荧光原位杂交技术是环境微生物学研究的有力工具，基于种属特异性的探针检测方法用于检测环境样本中的“两虫”已有大量报道。

对于贾第鞭毛虫属，大多数荧光原位杂交检测均针对核糖体小亚基（SSU）rRNA基因的可变区。使用荧光原位杂交在供水样品中对贾第鞭毛虫和隐孢子虫（小隐孢子虫和人形隐孢子虫）进行物种特异性鉴定和生存能力的研究也有报道[11]。研究称，该鉴定技术通常需要富集步骤（如采用磁珠富集），以提高灵敏度。此外，荧光原位杂交技术具有在3 h内检测、鉴定水体中致病性隐孢子虫的优点。荧光原位杂交在物种特异性检测和鉴定基础上，还能指示病原生物的生存能力。Smith等[12]使用荧光原位杂交测定微小隐孢子虫卵囊的活力，证实了该检测技术的可行性。

荧光原位杂交技术不需要经过国标中淘洗后再回收步骤，保证了该检测技术的回收率，且能测定胞囊或卵囊的活性，具有较好的应用前景,但该技术劳动强度较大，可能需要较多人工。

2 聚合酶链式反应

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是功能强大的分子生物学技术工具，可以大量扩增与预期靶标相对应的基因序列。与传统方法相比，PCR技术具有高自动化和高通量的优点，且比传统方法更灵敏，已广泛应用于隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检测和基因分型[13]。向飞宇等[14]利用PCR技术检测奶牛粪便中的隐孢子虫，可检测出含445个卵囊的样品，其灵敏度与常规检测相比有很大提高。耿艺介等[15]建立了水源微小隐孢子虫PCR鉴定方法，并成功用于水源水的隐孢子虫检测。

除了PCR的广泛应用外，以PCR为基础原理的检测技术还有巢式PCR、基于PCR的限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术等。巢式PCR使用2组引物，其中第1组引物与目标DNA外部的序列结合，扩增的区域用作第2对引物的模板。这样反应的特异性提高了，因为如果第1对引物存在非特异性结合，那么第2组引物就不太可能与非特异性扩增的DNA模板结合。巢式PCR已用于测定地表水、集水区和废水样品中的贾第鞭毛虫和隐孢子虫属[16]。

基于PCR的限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术利用特异性引物对不同的基因位点进行选择性扩增，然后酶切或测序，常被用于隐孢子虫和贾第鞭毛虫种或“基因型”描述和分类[17-18]。

3 实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（qPCR）已广泛用于环境样品病原体的检测[19]。qPCR可以实时监测DNA扩增。与传统PCR只能终点分析相比，在较宽的动态范围内对遗传靶标进行定量分析是qPCR的优点之一。荧光定量PCR阈值循环数（Ct）与靶基因的初始拷贝之间存在正比例关系。利用已知数量的基因拷贝产生的标准曲线，比较未知样本的Ct值，可以估计目标基因的准确基因拷贝数。该方法大大提高了检测灵敏度和特异性，并能缩短检测时间和节省劳力，使之成为病原体检测的首选方法。

qPCR在环境样品中“两虫”的检测和定量分析中已得到大量应用[13]。qPCR一般选择隐孢子虫的SSU rRNA、18S rRNA基因序列、贾第鞭毛虫的β-giardin等基因序列作为靶标基因。针对不同的靶标序列，宋悦等[20]比较了3种实时荧光定量PCR方法检测隐孢子虫，发现均能有效检测隐孢子虫。除了qPCR技术，李佳等[21]、廖立珊等[22]还分别建立了“两虫”检测的双重荧光定量PCR方法，可以在同一个荧光PCR反应中完成2种虫体基因的检测，大大提高了检测效率。

4 数字PCR

利用qPCR对环境样品中的病原体进行定量，首要的是要建立标准曲线，而该过程相对复杂。即使经过复杂的操作，标准曲线建立完成后，定量结果也会受到各种因素干扰。反应体系中不确定的PCR抑制剂可能会延迟Ct值，从而导致模板拷贝数的低估。

近年来，新发展起来的数字PCR技术有望解决绝对定量这一难题。在数字PCR反应中，样品被稀释并分成若干个小室，以便每个小室在PCR扩增前包含一个或零个靶序列的拷贝。样本中目标DNA的准确拷贝数可以通过计算阳性和阴性的数量来确定。然而，即使在充分分配样品条件下，每次反应有一个以上靶序列的拷贝的可能性始终存在。现有2种类型的数字PCR平台：芯片式数字PCR和微滴式数字PCR（ddPCR），相关研究也多有报道[23-24]，但它在环境方面的应用还十分有限。Yang等[25]比较了ddPCR和qPCR对以18S rRNA和肌动蛋白基因为靶点的隐孢子虫定量。采用不同浓度的隐孢子虫DNA模板比较2种方法的线性、灵敏度和精密度。一方面，qPCR和ddPCR表现出明显的线性关系，并且ddPCR精密度优于qPCR，且受PCR抑制剂的影响较小；另一方面，ddPCR精密度随DNA浓度的降低而降低，qPCR则不受模板浓度的影响。根据这一研究结果，Zahedi等[26-27] 使用ddPCR对隐孢子虫qPCR标准曲线的标准品进行准确定量，从而提高qPCR的定量准确性，使之更利于隐孢子虫的检测，且节约成本。

5 环介导等温扩增

为了提高PCR扩增效率，减少非特异性序列残留共扩增，Notomi等[28]提出了一种新的简便方法，称为环介导等温扩增（LAMP）。该方法由Bst DNA聚合酶驱动，使用了一组4个精心设计的引物（内部引物和外部引物），这些引物可识别靶标DNA上总共6个不同的序列。LAMP方法可以在等温条件下以高特异性和高灵敏度扩增大量DNA。它已被开发用于不同的病原体，包括细菌、病毒、真菌和原生动物寄生虫。该方法首先由Karanis等[29]用于隐孢子虫检测，之后又被用于贾第鞭毛虫的检测[30]。我国研究者也运用该方法对两虫进行检测[31]，建立的LAMP检测方法快速、简单且灵敏，但存在产物复杂、不便于测序和分型等缺点。

Mahmoudi等[32]结合免疫荧光法、聚合酶链式反应（PCR）和LAMP方法对地表水样品中隐孢子虫和贾第鞭毛虫进行检测，结果发现，大约37.5％的地表水样品中的目标原生动物寄生虫呈阳性，LAMP方法比PCR法更灵敏。

6 结论和展望

本文综述了水环境中隐孢子虫和贾第鞭毛虫分子生物学检测技术。分子生物学技术的发展促使其在隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测中得到广泛应用，不仅在检测灵敏度、准确度方面得到明显提升，在检测方法上更具多样性，操作也更加便利，分子生物学技术已经成为贾第鞭毛虫和隐孢子虫检测中的重要工具。针对不同的靶标，研究者开发出多种适合于不同检测目的的技术方法（表2）分别用于定性检测和定量检测。基于其缩短检测周期、节约人力物力等的明显优势，在“两虫”检测应用中有着广阔的前景。

值得注意的是，分子生物学技术给“两虫”检测带来了更加便利和准确操作方法的同时，由于扩增过程中也会把死亡的“两虫”基因片段扩增出来，导致难以分辨检测得到的目标是否存活或是否具有感染性，且大多分子生物学方法的检测技术仅能获得定性或相对定量的结果，给基于此技术的水质判定增加了难度，容易引起水质的误判。针对活性问题，有研究者在PCR技术基础上结合核酸染料，如丙叠氮（PMA）来化解这一难题。PMA是一种膜损伤染料，只能穿透膜受损的细胞。PMA进入细胞后，经光激活后与DNA共价交联，PCR扩增受到强烈抑制，这种受到强烈抑制而未获得扩增片段的情况可被认为样品中不含有活性的“两虫”。该技术目前在病原微生物检测中得到了一定发展，我国研究者就有采用PMA-PCR技术对收集到的污水样本中“两虫”的污染情况进行的评估报道[37]。

针对水中两虫绝对定量检测技术的需求，数字PCR绝对定量技术则指出了新的方向。但相较于其他分子生物学方法，数字PCR技术在隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测中还没有得到广泛应用，现有的信息也很有限，其在“两虫”检测中的应用还有待进一步探索。但随着研究者的不断努力，数字PCR这一新的途径或许会在“两虫”定量快速检测中发挥巨大作用。

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基金项目：烟台市重点研发计划（2018SFGY072）

第一作者：段效辉（1978—），女，山东临沂人，高级工程师，博士，主要从事食品安全检测和研究，E-mail: xiaohuiduan@126.com

1. 烟台海关技术中心 烟台 264000

1. Technology Center of Yantai Customs, Yantai 264000