胡佳续1 赵卫东1 林 宇1 张裕君1 王 可2 侯泓旭2 魏亚东1 廖 芳1

关键词 黑麦草；种子；黑麦草花叶病毒； RT-PCR；系统进化分析

Quarantine and Identification of Ryegrass Mosaic Virus

in US Ryegrass Seed

HU Jia-Xu1 ZHAO Wei-Dong1 LIN Yu1 ZHANG Yu-Jun1

WANG Ke2 HOU Hong-Xu2 WEI Ya-Dong1 LIAO Fang1

Abstract Aiming to ensure border biosafety and prevent ryegrass mosaic virus (RGMV) from invading China, Tianjin Customs plant quarantine laboratory has successfully detected RGMV in a batch of ryegrass seeds imported from the United States by RT-PCR, sequence alignment and phylogenetic analysis. RGMV endangers gramineous plants and has been widely distributed in many countries. It is the first time that RGMV was intercepted at ports across the country.

Keywords ryegrass; seed; ryegrass mosaic virus; RT-PCR; phylogenetic analysis

黑麦草（Lolium perenne L.），属于被子植物门（Angiospermae），单子叶植物纲（Monocotyledons），禾本目（Poales），禾本科（Gramineae），黑麦草属（Lolium），植株高度为80～120 cm，直径约为0.5 cm，茎杆直立柔软，叶片柔软，具微毛，有时具叶耳^[1]。黑麦草原产于地中海沿岸，目前世界各地普遍引种栽培，多用于牧草、饲料及观景草坪等。黑麦草植株生长速度快，抗逆性强，是禾本科牧草中产量最高的牧草之一，十分适合驯养马、牛、羊等^[2]。黑麦草气味香甜，草质柔嫩，富含多种维生素及矿物质，蛋白质含量丰富，高达23%以上，十分具有营养价值，可直接喂养鹅、兔、鹿、鸵鸟、猪、鱼等^[3]；黑麦草还可以与其他草种混种，可保持全年常青，常用于运动场、高尔夫球场等地；黑麦草是重要的绿化植物之一，绿化草坪可以减少噪音，改善道路两旁的景观以及周围的生态环境。在我国北方气温较低的地区表现为一年生，在我国南方地区表现为越年生或短期多年生^[4]。

黑麦草花叶病毒，属于RNA病毒域（Riboviria），正RNA病毒界（Orthornavirae），小RNA超群病毒门（Pisuviricota），马铃薯病毒纲（Stelpaviricetes），马铃薯病毒目（Patatavirales），马铃薯Y病毒科（Potyviridae），黑麦草花叶病毒属（Rymovirus），病毒颗粒无包膜，呈螺旋对称结构，病毒颗粒长690～720 nm，直径11～15 nm，为弯曲线状。RGMV核酸相对分子质量为2.7×10⁶，为单分子线性正义单链RNA，长度为9～10 kb。外壳蛋白分子质量为29.2 kDa，由一种多肽组成。该病毒为单分体基因组，RNA的5'端为VPg（基因组连锁病毒蛋白），3'端为Poly (A)（重复腺嘌呤序列）。基因组编码一个多聚蛋白，长348 kDa，切割后产生10个产物，分别为P1蛋白（蛋白酶）、HC-Pro蛋白（辅助成分蛋白酶）、P3蛋白（功能未知）、6K1蛋白（功能未知）、柱状内含体解旋酶、6K2蛋白（功能未知）、VPg、NIa蛋白（核内含体蛋白酶）、NIb蛋白（核内含体复制酶）及外壳蛋白^[5]。目前该病毒的基因组已完成测序，在血清学方面与属内其他3种病毒无关联。在感病黑麦草叶片细胞中，细胞核内出现丝状束样的内含体，同时细胞质中存病毒颗粒及风轮状内含体，细胞病变特征与马铃薯Y病毒属相似^[6]。

2004年，欧洲和北美首次发现该病毒。可通过昆虫传播，例如瘿螨类的猥草瘿螨（Abacarus hystrix），还可通过种子传播，也可通过机械接种传播^[7]。染病黑麦草植株表现为浅绿色或黄色花叶症状，一年生黑麦草干草产量损失可达27%。美国俄亥俄州感染该病毒的小麦植株^[8]出现花叶、褪绿、红化等症状，作物质量受到严重影响。目前该病毒已在美国、加拿大、澳大利亚、新西兰等黑麦草种植区流行^[9]，我国尚无该病毒发生的相关报道。

黑麦草花叶病毒的寄主为禾本科植物，例如鸭茅、燕麦、大麦、黑麦草、稻、早熟禾、谷子、小麦、玉米等，其中黑麦草在我国从南到北大面积种植，而水稻、燕麦、小麦等则是我国主要粮食作物。我国每年大量进口黑麦草种子，带毒种子一旦进入农田，将对我国农业生产造成严重影响。因此必须加强口岸检疫，防止该病毒传入和传播。2021年8月，天津海关植物检疫实验室采用 RT-PCR 技术，核酸测序，数据库比对以及构建系统进化树等方法，从来自美国的一年生黑麦草种子中检出 RGMV，这也是我国口岸首次截获 RGMV。本文介绍了该病毒的检出方法。

1 材料与方法

1.1 材料

样品为2021年8月，来自美国俄亥俄州的一年生黑麦草种子，随机挑取100 g，表面无明显症状，于4℃保存（图1）。

图1 美国一年生黑麦草种子

Fig.1 Annual ryegrass seed from America

1.2 试剂与仪器

采用德国QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit对植物样本进行总RNA提取。使用大连TaKaRa公司的检测试剂盒 PrimeScript One Step RT-PCR Kit 对总RNA进行反转录扩增^[10]，采用TaKaRa 公司的Marker 2000作为分子量标准。研磨仪TissueLyser II购自QIAGEN公司。

1.3 植物总RNA提取

将供试样品编号为1037，研磨成粉，称取100 mg粉末，使用RNeasy Plant Mini Kit提取样品RNA，于-20℃冰箱保存备用。

1.4 RT-PCR

使用PrimeScript One Step RT-PCR Kit 进行核酸扩增。根据NCBI已发布的RGMV全基因组序列，自行设计特异性引物，RGMV-F4/ RGMV-R4(5'-ACGAGCGGGCTATGCTAAAC-3'/5'- ATTCGTCTTTGCCTCTCCG-3')，对RGMV衣壳蛋白（capsid protein, CP）基因进行扩增。阳性对照样品来自本实验室样本库。反应体系按照PrimeScript 一步法反转录扩增试剂盒说明书。反应程序为：第一步50℃持续30 min；第二步94℃持续2 min；第三步94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循环 38 次。2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物^[10]。

1.5 序列分析及同源性比较

对RT-PCR产物进行克隆测序，由上海生工生物工程有限公司完成，利用Dnaman8.0软件将测得序列进行装配拼接，登录美国国家生物技术信息中心进行序列同源性比较分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/），采用 MEGA7.0软件进行序列多重比对以及系统进化树分析^[10]，使用最大相似法（ML） 构建系统发育树，自举（Bootstrap）检验重复5000 次。用于比较和建树的病毒序列包括 RGMV、冰草花叶病毒（agropyron mosaic virus, AgMV）、大麦花叶病毒（hordeum mosaic virus, HoMV）、燕麦坏死斑驳病毒（oat necrotic mottle virus, ONMV）。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR

将1037 样品提取总 RNA ，经过 RT-PCR扩增后，其产物经2% 琼脂糖凝胶电泳检测，得到约280 bp的特异片段，与阳性对照长度一致，阴性对照与空白对照相应位置上无任何扩增条带（图 2），电泳结果表明1037样品经扩增后为阳性。将此带毒样品命名为RGMV-1037。

M:核酸分子标记DL2000; 1:黑麦草种子; 2:黑麦草种子; 3:阳性对照; 4:阴性对照; 5:空白对照

M: DNA Marker DL2000; 1: Samples; 2: Samples; 3: Positive control; 4: Negative control; 5: Blank control

图2 黑麦草种子中RGMV RT-PCR扩增结果

Fig.2 Amplification of RGMV from ryegrass seeds by RT-PCR

2.2 基因序列分析

将RGMV-1037的RT-PCR产物克隆，测序结果表明该扩增片段含有304个碱基对，碱基G＋C的含量为56.9%（图3）。将该序列导入GenBank，使用BLAST 程序对其进行同源性检索，结果显示RGMV-1037与黑麦草花叶病毒基因序列相似度均达到90%以上。其中与丹麦株系（登录号KR061300.1）相似度最高，为95.39%，与澳大利亚株系（AF035637.1）相似度为94.74%，与保加利亚株系（AY014274.1）相似度为92.38%，与捷克株系（AY014275.1）相似度为91.72%，与新西兰株系（AF091244.1）相似度为92.72%，而与其他病毒的基因相似度均在70%以下，表明RGMV-1037为黑麦草花叶病毒。

2.3 系统树构建与分析

收集已发布的黑麦草花叶病毒属基因序列，与RGMV-1037所测定的基因序列进行同源性分析，使用MEGA7.0软件，构建系统发育树（图4），基因序列变化强度表现为进化树的分支长度。由系统发育树可以看出，所收集的病毒序列聚为4个大支，分别为黑麦草花叶病毒、冰草花叶病毒、大麦花叶病毒、燕麦坏死斑驳病毒，RGMV-1037与其他地区的黑麦草花叶病毒聚在一支，且与丹麦株系亲缘关系最近，这与序列相似性比较结果一致，进一步表明RGMV-1037为黑麦草花叶病毒。

3 结语

目前，关于RGMV的CP基因同源性以及系统进化分析尚无报道。本研究首次发现美国黑麦草中RGMV与丹麦株系亲缘关系最近，但核酸相似度仅95%，核苷酸序列变异位点较多，且变异速度较快。根据系统进化树可以看出，不同地区毒株差异较大，且具有一定的地理分布特点，其中欧洲三个株系与澳洲维多利亚株系聚为一支，捷克株系与澳洲阿克顿株系聚为一支，此次的美国株系独立一支，这可能由于种子调运或是当地植株生长环境差异造成的。本研究可为制定黑麦草花叶病毒防控策略及进一步研究该病毒的流行学提供理论基础。

目前已报道的黑麦草病害主要是真菌性病害，如黑粉病、网斑病、灰斑病等，而病毒性病害种类较少，只有多花黑麦草斑驳病毒（ryegrass mottle virus, RGMoV），属于南方菜豆花叶病毒属病毒^[11]，未有截获报道。RGMV没有列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，也不是限定的非检疫性有害生物，目前还未对该病毒采取检疫措施，在此之前无截获记录。

RGMV传播媒介主要为瘿螨类昆虫，我国瘿螨分布于广东、四川和云南等地，有利于该病毒的定殖。RGMV一旦定殖下来，自然传播主要是通过瘿螨完成；人为传播主要是通过种子调运、运输过程中的洒落、农事操作等完成。以上因素既可以单独实现RGMV的扩散，也可以多种因素综合叠加实现病毒的快速扩散。目前，我国尚无该病毒发生的报道。但我国每年大量进口黑麦草种子，RGMV符合检疫性有害生物的地理和管理标准，进入、定殖和扩散的可能性大，经济影响大，检疫风险为高。

建议将RGMV列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，对其保持高度警惕，并加强对黑麦草种子调运的检疫监管，及时处理带毒种子，严防其入侵、定殖和扩散，防止黑麦草花叶病毒在我国流行，保护我国农业生态安全。

参考文献

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基金项目：国家重点研发计划国家质量基础（NQI）课题（2017YFF0210305）

第一作者：胡佳续（1984—），男，汉族，天津人，博士，农艺师，主要从事植物检疫，E-mail: huhu2544@sina.com

1. 天津海关动植物与食品检测中心 天津 300461

2. 天津市滨海新区农业农村发展服务中心 天津 300450

1. Tianjin Custom Animal Plant and Foodstuffs Inspection Center, Tianjin 300461

2. Tianjin Binhai New Area Agriculture and Rural Development Service Center, Tianjin 300450