张信仁1 刘正才2 陈泽宇1 张 云1

关键词 辣椒油；阿片生物碱；标准样品；稳定

Study on Stability of Opium Alkaloid Standard Sample in

Chili oil

ZHANG Xin-Ren1 LIU Zheng-Cai2 CHEN Ze-Yu1 ZHANG Yun1

Abstract The stabilities of five opioid alkaloids including morphine, codeine, papaverine, nacotin and tibaine in chili oil matrix were studied. The stabilities of five standard samples of opioid alkaloids in chili oil were investigated by storing them at different temperatures and for different periods of time, based on BJS 201802. The stabilities of five kinds of opioid alkaloids in the standard sample of chili oil appeared differently under different storage conditions. The five opioid alkaloids in the standard sample of pepper oil were stable when stored at -18℃ for 12 months, while papaverine had the best stability and tibaine had the worst stability when stored at room temperature and lower temperatures.

Keywords chili oil; opioid alkaloids; standard sample; stability

罂粟壳是罂粟科植物罂粟采完鸦片后的干燥成熟果壳，含有20多种生物碱，其中主要成分为罂粟碱、那可丁、蒂巴因、可待因和吗啡^[1]。罂粟壳具有一定的成瘾性^[2]。一些不法商贩为招揽顾客，牟取暴利，在火锅底料、调味料、酱卤肉或肉汤中添加罂粟壳等违禁原料。长期食用含有罂粟壳成分的食物，会对人体神经系统造成损害，并可能造成慢性中毒^[3]，严重时还可能出现精神失常或幻觉，甚至会导致死亡^[4]，因此，我国禁止在食品中添加此类物质并进行严格监管，这也是每年食品安全重点检查项目^[5]。

开展食品中违法添加罂粟壳的检查工作离不开对其进行分析检测，获得准确可靠的分析检测结果则离不开检测所需的标准物质。然而在对食品中那可丁、罂粟碱、蒂巴因、可待因和吗啡5种阿片生物碱的检测过程中，由于基体成分复杂，易对检测结果造成干扰，因此在检测校准或质量控制时不宜采用纯品标准物质，需有相应基质的质控样进行校正，才能确保检测结果的准确性^[4]。由此可见，基质标准物质稳定性至关重要，直接影响测量数据的准确性，从而影响到此类案件的定性和处罚依据的可靠^[4]。目前，在食品安全检测控制领域，已有一些关于罂粟壳成分残留检测的研究性论文^[1-3,5-10]，研究的食品种类较多，有固体非脂食品、固体含脂食品、液体非脂食品和液体含脂食品等^[11-15]。但是对其检测质量控制的研究较少，质控样研究可见固体复合香辛料中罂粟壳质控样的制备^[4]，以及生物样品中吗啡在不同保存条件下稳定性的研究^[16]，而对餐饮食品安全事件发生最多的常见食品基质中5种阿片生物碱标准物质稳定性的研究尚无公开文献报道。因此，本研究可为此类样品采集、保存要求、检测时效作出规范时提供参考，无论是对检测过程的质量控制和检测结果的准确性，还是对标准物质研发、生产和制备，以及确保食品安全均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 仪器、标准品与试剂材料

AB3500三重四极杆质谱仪（美国AB Sciex公司）；岛津超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；氮气发生器（美国Atlas公司）；Milli-Q Reference超纯水机（美国Millipore公司）；HMV-50A脉动式多管涡旋振荡器（天津市恒奥科技发展有限公司）；Allegra 64R冷冻台式高速离心机（美国Beckman Coulter公司）；XS204型电子分析天平，分度值为0.00001 g（瑞士Mettler Toledo公司）；XW-80A旋涡混合器（上海精科实业有限公司）。

标准品（福州奥研公司）：吗啡（标准号PM440500，纯度≥99.0%）；盐酸罂粟碱（标准号PVR-494032，纯度≥98.0%）；磷酸可待因（标准号C-006，浓度1 mg/mL）；那可丁（标准号N1300000，浓度1 mg/mL）；蒂巴因（标准号T-116，浓度1 mg/mL）；吗啡-D3（标准号67293-88-3，浓度0.1 mg/mL）；可待因-D3（标准号70420-71-2，浓度0.1 mg/mL）。甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；无水乙酸钠及无水硫酸镁（AR，西陇科学股份公司）；尼龙针式滤膜（0.22 µm，天津津腾公司）。试验所用样品来源于本中心所制备的基质标准样品。

1.2 标准溶液制备

样品中5种阿片生物碱标准溶液配制参考BJS 201802《食品中吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁和蒂巴因的测定》进行^[17]。5种阿片生物碱标准品的总离子流图和多反应监测MRM色谱图如图1所示。

图1 5种生物碱标准品的总离子流图和多反应监测MRM色谱图

Fig.1 Total ion flow diagram and MRM chromatogram of five alkaloid standards

1.3 标准样品制备

在阴性辣椒调味油样品中加入一定浓度和比例的含吗啡、可待因、蒂巴因、罂粟碱、那可丁5种混合标准物质，配制辣椒油基质中含吗啡和可待因各100 µg/kg，蒂巴因、罂粟碱和那可丁各20 µg/kg的标准样品，充分振荡混匀后，用40 mL棕色玻璃瓶配套密封垫和盖分装成独立密封包装的小瓶，每瓶装量约25 mL，并进行均匀性检测。在确保基质标准样品的均匀性后，分别存放于常温（30±5）℃、冷藏（4±2）℃、冷冻（-18±3）℃条件下进行稳定性测试。

1.4 样品中5种罂粟碱类含量的测定方法

参考BJS 201802中的方法进行测试。

1.5 稳定性研究试验条件

1.5.1 储存条件

制备好的基质标准样品经均匀性检测符合要求后，需储存在不同温度条件下进行短期稳定性和长期稳定性试验，为此需要常温、冷藏、冷冻 3个不同温度的固定储存场所。常温场所为带锁柜子常温存放，冷藏和冷冻分别需用带温度显示和温度监控并能上锁的冰箱。3种温度储存场所每周分别监测2～3次温度，按规定时间间隔取样检测各自含量，并与初测值对照比较。

1.5.2 取样检测要求

根据本项目研究方案，每间隔1个月、2个月、4个月、6个月、9个月和12个月，分别随机抽取3个温度储存场所的独立包装样本2个，每个样本重复测试3次，统计分析测试结果。

1.5.3 色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC BHE C₁₈柱（2.1 mm×50 mm, 1.7 µm）或ACQUITY UPLC HSST3 （2.1 mm×100 mm, 1.8 µm）色谱柱，进样量5 µL，色谱柱温度35℃，流动相流量0.3 mL/min。

流动相A：乙腈（色谱级）；流动相B：0.1%甲酸水溶液（内含5 mmol乙酸铵）。

梯度洗脱程序：0～1.0 min, 90%A；1.1～4.0 min, 25%A；4.1～5.0 min, 90%A。

1.5.4 质谱条件

可加热的电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描模式；离子源电压（IS）：5500 V；离子源温度：550℃；气帘气压（CUR）：172.4 kPa；碰撞气压（CAD）：62.1 kPa；喷雾气压（GS1）：379.2 kPa；加热气压（GS2）：379.2 kPa；采集模式：MRM。5种阿片生物碱及其内标化合物质谱参数见表1。

1.6 统计学应用

样品均匀性采用单因素方差分析，显著水平α＝0.05时，其结果均未见显著差异，即F＜F_crit，样品是均匀的，且根据GB/T 15000.3-2008^[18]，基质标准样品需考虑长期与短期稳定性。基质标准样品在10 d内短期是稳定的，本项目以长期稳定性研究为基础，稳定性检验的统计采用t检验法，以初测值作为标准值或参考值进行比较，一系列测量的平均值按式(1)计算t值：

(1)

2个平均值之间的一致性按式(2)计算t值：

(2)

式(1)和(2)中，μ为标准值/参考值（初测值），为第X次测试的均值，n为第X次测试的测量次数，S为第X次测试的标准偏差。本研究中，μ为初测值，即。为便于冷藏和常温储存一定时间后与初测值比较计算，采用各个时间段检测值与初测值比较，按照2个平均值之间的一致性计算t值。

若t＜显著性水平α（通常α＝0.05）自由度为n－1的临界值，则平均值与初测值（即标准值或参考值）之间无显著性差异，说明在此储存条件下，相对应的储存时间内基质标准样品是稳定的；反之，若t＜t_a(n-1)（通常α＝0.05），说明在此储存条件下对应的储存时间内测定的平均值与初测值存在较大差异，是不稳定的。

2 结果与分析

2.1 结果

辣椒油中罂粟碱、吗啡、蒂巴因、可待因和那可丁5种罂粟壳主要成分的阿片生物碱基质标准样品在不同储存条件下的不同时间点测定其含量变化：在冷冻储存12个月，5种阿片生物碱物质是稳定的（表2）；在冷藏、常温储存时，随着储存时间的不同，5种阿片生物碱物质稳定性各不相同。其中，罂粟碱最稳定（表2～4），蒂巴因稳定性最差（表5～6），吗啡、可待因和那可丁冷藏储存1个月是基本稳定的（表5），但随储存时间的延长，其不稳定性逐渐显现；在常温储存时，除罂粟碱外，其余4种均不稳定。

2.2 分析

2.2.1 基质样品选择代表性

试验所用辣椒油为本中心检测为阴性的火锅食品底料，经滤网过滤，去除火锅残渣和辣椒籽后得到澄清的麻辣汤油。因5种阿片生物碱大多含有氮杂环基因，具有碱性，属于仲胺和叔胺类化合物，大多不溶或难溶于水，只有经过酸化为盐后才可溶于水中^[19]，因此，取火锅底料的辣椒油作标准样品基质，与实际样品的真实情况较为接近，具有一定代表性。

2.2.2 基质效应影响

火锅食品是由各种食材、香辛调味料、植物油或动物油脂混合后经长时间熬制而成，食材、香辛料成分均可能溶解、浸提于火锅底料汤油中，成分极为复杂，各种成分基质效应及对5种阿片生物碱标准物质干扰影响各不相同，因此，用此类食品基质制作的含5种阿片生物碱标准样品，除各自化学结构和特性不同外，基质干扰影响其稳定性各不相同也是一个重要因素。

2.2.3 检测限说明

参考BJS 201802的附件1，其检测限为吗啡和可待因各40 µg/kg，蒂巴因、罂粟碱和那可丁各8 µg/kg。为便于试验对比分析，在本方法检测限及以下的数据为仪器分析得出，仅供试验对比参考。

2.2.4 基质标准样品不同储存条件

本研究考察了辣椒油基质标准样品在冷冻、冷藏和常温条件下的稳定性。结果表明，罂粟碱在3种不同温度条件下存储12个月均稳定，吗啡、可待因、那可丁和蒂巴因不适宜冷藏储存和常温储存。虽然在冷藏条件下吗啡、可待因和那可丁储存1个月是稳定的，但是后续不稳定性逐渐显现。

2.2.5 其他因素对基质标准样品稳定性的影响

本试验仅研究了不同储存时间、不同储存温度对5种阿片生物碱标准物质稳定性的影响，据有关文献报道，不同食品基质、pH值、储存容器、抗氧化剂和防腐剂等因素也可能对储存样品中5种阿片生物碱标准物质稳定性产生影响^[4,16,20-22]。例如：吗啡分子结构中具有羟基，属于酚类化合物，极易被氧化（本试验基质标准物质采用带密封盖的棕色标准样品瓶分装，可有效防止吗啡被氧化）。因为吗啡在碱性条件下相对较稳定，若添加抗氧化剂和控制适当的pH值，将有助于吗啡标准物质的稳定性，但是对其他物质是否有影响还需进一步实验证实。

3 结论

检测用标准样品的稳定性受物理、化学、生物性等多因素制约，不同影响因素之间又相互影响，有促进也有抑制，其因素影响程度随不同类别的标准样品而各不相同^[21]。稳定性试验是标准样品研发和生产过程中需要考察的关键因素，同时是最为繁杂和耗时的考察内容。该指标极为重要，因为其关系到标准样品的储运条件和使用期限的确定，与检测结果的准确性密切相关^[18]。尤其是基质标准样品对同类基质样品检测结果的准确性影响更大，基质成分复杂多样，对目标物的影响随着储存条件不同而不断变化，只有对其稳定性研究透彻，才能制作出高质量的基质标准样品，对促进检测技术发展，保证测量结果的准确性和可靠性，以及分析结果的一致性和可比性发挥重要作用。

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基金项目：福州海关科研项目（FK2021-11），国家标准样品研复制项目（S2019328）

第一作者：张信仁（1966—），男，汉族，福建宁化人，学士，高级工程师，主要从事进出口食品安全检验，E-mail: smzhxr@126.com

1. 三明海关 三明 365000

2. 福州海关技术中心 福州 350001

1. Sanming Customs, Sanming 365000

2. Technology Center of Fuzhou Customs District, Fuzhou 350001